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目的:对比分析重症肌无力(Myasthenia Gravis，MG)患者与健康对照者(healthy controls，HCs)外周血CD4<+>CD25<+>调节性T细胞(CD4<+>CD25<+>Tregs)数量、免疫抑制功能及其表面因子CTLA-4、CD45RO、FoxP3、LAG-3的表达改变，在细胞与分子水平验证MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs的免疫抑制功能缺陷和基因表达调控障碍，探讨CD4<+>CD25<+>Tregs参与MG发病的可能机制。
方法:(1)流式细胞技术检测21例MG患者(11例患者经胸腺切除)与20例HCs外周血CD4<+>CD25<+>Tregs含量及CD4<+>CD25<+>Tregs表面分子CTLA-4、CD45RO、FoxP3、LAG-3的表达。(2)磁性活化细胞分选(Magnetically activated cell sorting，MACS)法纯化MG患者与HCs外周血单个核细胞(mononuclear cells，MNC)中CD4<+>CD25<+>Tregs和CD4<+>CD25-T细胞。(3)MG患者与HCs外周血CD4<+>CD25<+>Tregs与羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE)标记的同源CD4<+>CD25<->T细胞按照1：1的比例进行混合淋巴细胞培养，流式细胞技术检测两者CD4<+>CD25<+>Tregs的免疫抑制功能。(4)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescentquantitative PCR，RT-FQ-PCR)检测MG患者与HCs外周血CD4<+>CD25<+>Tregs中FoxP3 mRNA和LAG-3 mRNA的表达。(5)评价MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs表面分子FoxP3和LAG-3的表达与胸腺切除治疗或Ossermann分型间的关系。
结果:(1)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs占CD4<+>T细胞百分比为(8.87％±1.99％)，与HCs(7.73％±3.27％)比较无显著性差异；胸腺切除的MG患者(8.48％±1.85％)与未经胸腺切除的MG患者(9.17％±2.17％)外周血CD4<+>CD25<+>Tregs含量亦无显著性差异。(2)MG患者和HCs外周血MNC经过MACS法分选纯化后，CD4<+>CD25<->T细胞纯度在90％～94％，CD4<+>CD25<+>Tregs纯度在85％～89％。(3)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs表达CD45RO(89.77％±7.79％)和CTLA-4(50.76％±28.42％)与HCs比较无显著性差异；而表面分子FoxP3(23.33％±11.60％)和LAG-3(28.37％±20.52％)在MG患者CD4<+>CD25<+>Tregs的表达同HCs 比较显著性降低。(4)混合淋巴细胞培养结果显示，HCs外周血CD4<+>CD25<->T细胞的增殖被自身CD4<+>CD25<+>Tregs有效抑制，增殖指数(Proliferation Index，PI)值为(1.48±0.15)；MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs抑制功能显著降低，同源CD4<+>CD25<->T细胞的PI值为(2.71±0.59)，两者PI值比较有显著性差异。(5)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs中FoxP3mRNA相对表达量(0.34±0.29)显著低于HCs(1.88±1.65)，LAG-3 mRNA相对表达量(0.23±0.19)亦显著低于HCs(2.45±1.62)；MG患者根据Ossermann分型或是否经过胸腺切除治疗分组后，各组间FoxP3 mRNA及LAG-3 mRNA表达无显著性差异。
结论:(1)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs数量正常，但其免疫抑制功能严重缺陷，不能有效抑制同源CD4<+>CD25<->T细胞的增殖。(2)MACS法可在体外分选纯化人外周血MNC中CD4<+>CD25<+>Tregs与CD4<+>CD25<->T细胞。(3)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs中FoxP3与LAG-3基因在mRNA转录与蛋白表达水平下调，可能与CD4<+>CD25<+>Tregs免疫抑制功能缺陷密切相关，并参与MG的发生与发展过程。(4)MG患者外周血CD4<+>CD25<+>Tregs中FoxP3与LAG-3的表达下调与胸腺切除治疗或Ossermann临床分型无关。