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目的:邻苯二甲酸二-2-乙基己酯（Di-2-ethylhexyl phthalate,DEHP）作为最为经济的塑化剂之一被广泛使用。但由于DEHP在各种产品中主要以游离形态出现,随着时间的增长慢慢渗出,并通过不同方式进入体内,对人体健康构成了威胁。最为严重的是干扰内分泌系统,损害生殖健康,导致发育动物精子密度低,生育能力下降。因此,了解DEHP造成生殖系统损伤的具体机制尤为重要。目前对于DEHP引起睾丸损伤的毒理机制仍未阐明,本实验拟探讨DEHP是否会引起大鼠睾丸细胞铁死亡,并且研究其可能的分子机制,为防治DEHP诱发的睾丸损伤提供新思路。方法:在体内实验中,将21只3周龄Sprague-Dawley雄性大鼠（70-110 g）随机分为3组:对照组,250 mg/kg处理组,500 mg/kg处理组。染毒的方法采用灌胃,每日一次,暴露的持续时间为5周。在染毒期间,大鼠可以随意饮食饮水。染毒结束后立即处死所有大鼠,并采集睾丸组织样本制备石蜡切片以进行后续研究。应用H＆E染色检测大鼠睾丸损伤情况;使用western blot测定大鼠睾丸组织中铁死亡相关蛋白（长链脂酰辅酶A合成酶4（Acyl Coenzyme A Synthetase Long Chain Family,Member 4,ACSL4）、环氧化酶 2（Cyclooxygenase 2,COX-2）、谷胱甘肽过氧化物酶4（Glutathione Peroxidase4,GPX4））、相关通路蛋白（表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR）、花生四烯酸 15-脂氧合酶（arachidonate 15-lipoxygenase,ALOX15）、p53、p-p53、p38α、p-p38α、亚精胺/精胺n1-乙酰转移酶1（diamine N-acetyltransferase1,SAT1））以及血睾屏障相关蛋白（胞质闭锁小带蛋白1（zonula occludens 1,ZO-1）和连接蛋白43（Connexin 43,Cx-43））的表达状况;应用试剂盒监测大鼠睾丸组织中MDA、GSH和铁的含量;使用血清铁试剂盒测定大鼠血清样本中铁的含量;应用ELISA试剂盒检测大鼠睾丸组织和血清样本中的睾酮水平。体外实验中,选择TM4细胞作为研究对象,不同浓度的邻苯二甲酸单-2-乙基己酯（Mono-（2-ethylhexyl）phthalate,MEHP）（0,25,50,100,200,400,800μM）处理细胞24h后,应用CCK-8溶液检测细胞存活率。用200 μMMEHP处理TM4细胞24h后,应用western blot检测铁死亡相关蛋白（ACSL4、GPX4、COX-2）和相关通路蛋白（EGFR、ALOX15、p53、p-p53、p38α、p-p38α、SAT1）的表达情况;应用BODIPY 581/591 C11荧光探针检测脂质ROS蓄积情况;应用相关试剂盒检测GSH和MDA含量。干预试验中,分别用脂质ROS清除剂fer-1或p38α小干扰RNA si-MAPK14预处理TM4细胞,再用200 μM MEHP处理细胞24 h后,应用western blot检测大鼠睾丸组织中铁死亡相关蛋白（ACSL4、GPX4、COX-2）、相关通路蛋白（ALOX15、p53、p-p53、p38α、p-p38α、SAT1）以及血睾屏障相关蛋白（ZO-1、Cx-43）的表达状况;应用BODIPY 581/591 C11荧光探针检测脂质ROS蓄积情况;应用相关检测试剂盒检测TM4内GSH和MDA含量。结果:体内实验中,睾丸组织H＆E染色结果表明,DEHP暴露5周后,与对照组相比,染毒组生精小管萎缩,500 mg/kg组大鼠睾丸内生精细胞间隙增宽,支持细胞缺失。500mg/kg组大鼠睾丸内铁死亡相关蛋白（ACSL4、COX-2）的表达、相关通路蛋白（EGFR、ALOX15、p53、p-p53、p38α、p-p38α、SAT1）的表达、MDA和铁的含量与对照组相比,显著上调。同时反映抗氧化能力的GSH含量和GPX4蛋白表达水平均下降。与对照组相比,500 mg/kg组大鼠睾丸组织中血睾屏障相关蛋白（ZO-1、Cx-43）的表达水平及睾丸组织和血清中睾酮的水平均下降。上述结论表明DEHP暴露导致了睾丸组织氧化性损害和铁死亡的产生,并导致了EGFR/p38α/p53通路中相关蛋白的上调,从而损害了血睾屏障（Blood-Testis Barrier,BTB）的完整性。体外实验中,TM4细胞暴露于不同浓度的MEHP 24 h后,细胞的存活率呈剂量依赖性地减少;用200 μM MEHP溶液处理TM4细胞24 h后,促铁死亡相关指标（ACSL4、COX-2、MDA、脂质ROS）水平均上调,抑制铁死亡相关指标（GSH、GPX4）下调,说明MEHP引起TM4细胞铁死亡;相关通路蛋白（EGFR、ALOX15、p53、p-p53、p38α、p-p38α、SAT1）的表达水平均增高,表明MEHP可以经由EGFR/p38α/p53通路导致TM4细胞铁死亡。分别用脂质ROS清除剂fer-1和p38α小干扰RNA si-MAPK14预处理TM4细胞,再用200 μMMEHP处理细胞24 h后,western blot结果显示:fer-1或si-MAPK14的预处理使COX-2蛋白和相关下游通路蛋白（ALOX15、p53、p-p53、p38α、p-p38α、SAT1）表达降低,血睾屏障相关蛋白（ZO-1、Cx-43）表达升高;细胞内GSH表达上升,MDA表达和脂质ROS生成显著下降。综上,在MEHP诱导的TM4细胞铁死亡中,p38α激活p53-SAT1-AlOX15通路,促进脂质ROS的积累,而脂质ROS亦可反向促进p38α的表达,从而形成一个恶性的反馈循环。结论:DEHP暴露引起大鼠睾丸铁死亡;其体内代谢产物MEHP通过p38α/p53通路和脂质ROS形成的反馈循环引起睾丸支持细胞铁死亡,并损伤血睾屏障完整性。