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益生菌是一类能够维持宿主健康的活微生物,能够改善肠道微生态平衡、分泌抗性物质、和致病菌竞争定殖位点和营养等从而对宿主生长和健康起到有益的作用。然而人们对芽胞杆菌调控肠道微生态平衡的机制知之甚少。 本研究以具有良好益生潜力的枯草芽孢杆菌 MA139(Bacillus subtilis MA139)为研究对象,探讨了其在模拟肠道环境中的作用机理。在选取的体外模拟肠道环境——MRS培养基(pH6.5)中,在微耗氧条件下,通过B. subtilis MA139与病原菌E. coli K88和有益菌乳杆菌之间的共培养试验表明:(1)E. coli K88在混合培养的条件下,其活菌数量没有明显的下降趋势。(2)在培养的12 h, B. subtilis MA139显著增加了 L. salivarius G1-1在培养液中的活菌数量(P<0.05),体系中的pH值显著低于纯培养(P<0.05);B. subtilis MA139对L. reuteri G8-5增殖的促进作用效果明显,尤其在6 h和12 h的时候,混合培养中,L. reuteri G8-5的数量比纯培养条件下分别增加0.42 log和0.20 log。在6 h时,B. subtilis MA139的存在使培养液中的pH从5.2降低至5.0。因此,在MRS培养液中,B. subtilis MA139在微厌氧条件下只能对E. coli K88发挥微弱的抑菌作用;在微厌氧培养条件的前期,外源B. subtilis MA139的添加对两株乳酸杆菌均有一定程度上的促进作用,并能显著降低体系的pH值。 在选取的体外模拟肠道环境——仔猪小肠液中,在微耗氧条件下,通过 B. subtilis MA139与病原菌E. coli K88和有益菌乳杆菌之间的共培养试验表明:(1)在前段小肠液中,在共培养终点,B. subtilis MA139将E. coli K88活菌数量从9.47 log降低至8.51 log(P<0.05),而在后段小肠液中,B. subtilis MA139未能表现出对E. coli K88的抑菌活性(P>0.05);(2)在培养的48 h和60 h,B. subtilis MA139能够促进L. salivarius G1-1的活菌数的显著增加(P<0.05);L. reuteri G8-5的数量显著高于纯培养组(P<0.05);因此,在微厌氧条件下,B. subtilis MA139在前段小肠液中对E. coli K88表现出一定的抑菌活性,B. subtilis MA139的芽孢在前段小肠液中对增加乳杆菌的活性具有一定的促进作用。 为了进一步探讨B. subtilis MA139在动物胃肠道中的分布、定植及其抑菌活性,本试验采用GFP标记的方法分别标记了外源的B. subtilis MA139和病原性的 E. coli K88。用标准的 B. subtilis168菌株 xylR基因的启动子和 B. subtilis MA139 rpsD基因的启动子分别替换质粒pGFP4412中蜡状芽孢杆菌4412启动子,从而构建了能在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达绿色荧光蛋白基因gfpmut3a的穿梭载体pGFP-xylR和pGFP-rpsD,通过限制性内切酶酶切、PCR等鉴定方法筛选出阳性克隆,并利用SDS-PAGE电泳检测GFP的基因在不同启动子诱导下的表达量。将三种携带gfp基因的质粒导入宿主菌B. subtilis MA139和E. coli K88中。筛选获得具有稳定发光表型的标记菌株E. coli K88-GFP,以及携带重组质粒的B. subtilis MA139的具有抗性的重组菌株B. subtilis MA139-GFP,并在荧光显微镜下能观察到有部分绿色荧光的菌体。构建的 GFP标记菌株为进一步研究外源的B. subtilis MA139在胃肠道内对E. coli K88的抑菌机理奠定了基础。