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目的:全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,atRA)是生物体内重要的生物活性物质,通过调节相应基因的转录参与细胞正常生长、增值、分化、凋亡,以及机体免疫调节、抗感染、抑制肿瘤细胞生长、增值等。有研究发现维甲酸水平高低可调控精子和卵子发生中的减数分裂过程。生殖细胞内必须保证一定维甲酸水平才能起始减数分裂。所以体内生理作用剂量的atRA受到严格的控制,其浓度的维持是由多种酶、多种蛋白因子参与的精细调节过程。atRA的合成为维生素A(亦称为视黄醇retinol)先氧化为视黄醛(retinal)再进一步氧化为RA。从Retinol到Retinal这一步为可逆反应,亦为atRA合成的限速步骤。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶( NADP(H)-dependent retinol dehydrogense/reductase,NRDR)在从视黄醇到视黄醛这一步中起着关键作用。编码 NRDR的基因在人体具有三个拷贝,分别命名为DHRS4、DHRS4L2和DHRS4L1,在黑猩猩、类人猿只存在两个拷贝,而在其他很多哺乳动物体内只存在DHRS4单拷贝,比如鼠、猪、牛等。 piRNA(Piwi-interacting RNA)是从哺乳动物睾丸组织中发现的一类能与PIWI蛋白相结合的小RNA,主要表达于不同物种的生殖细胞中,是继小干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA,miRNA)之后新发现的一类非编码小分子RNA。piRNA长度在26~31 nt左右,大部分集中在29~30 nt,在5’具有明显的尿嘧啶偏爱性(约86%),且80%以上在基因组中有单一位点。piRNA的表达有明显时序性,精子发育过程中进入减数分裂粗线期会产生PIWI蛋白,伴随PIWI蛋白的生物发生会出现大量的piRNA,使得减数分裂顺利进行。因此,piRNA被认为是生殖细胞减数分裂的重要事件之一。 生殖细胞发生减数分裂的另一个必要条件是细胞内要保持一定维甲酸(Retinoic Acid,RA)水平。那么体内对维甲酸起调控作用的NRDR水平是否会受到piRNA大量出现的调控呢?为探讨二者间的内在联系,我们针对小鼠DHRS4基因的piRNA设计单链转染序列,研究其piRNA的改变是否会调控DHRS4基因的表达,以致影响NRDR。此外也探讨了外源性piRNA对内源性piRNA是否有调控作用。 方法:利用生物信息学方法查找 DHRS4基因上的piRNA位点,设计合成短单链piRNA,将其转染小鼠睾丸畸胎瘤(P19)和小鼠睾丸间质细胞(TM4),24小时候后收获细胞,通过RNA提取,RT-PCR,real-time PCR,蛋白免疫印迹方法检测小鼠DHRS4基因表达情况。此外通过转染外源性piRNA,检测内源性piRNA的表达情况。 结果:通过实验发现位于DHRS4基因中第二内含子区域的2个piRNA中有一个促进DHRS4基因的表达。并且发现外源piRNA对内源piRNA的表达也有促进作用。 结论:piRNA对靶基因表达可能还有正向调控作用,丰富了piRNA的生物学功能;外源piRNA对内源piRNA的表达有正向调控作用,为阐明piRNA的生物发生机制提供可靠的实验依据。