鳙鱼GABA受体的分离与纯化

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γ-氨基丁酸(GABA)是脊椎动物和无脊椎动物中枢神经系统内重要的抑制性递质,其传递作用由GABA受体介导,该受体是各种有机氯类以及氟虫腈、阿维菌素类杀虫剂的作用靶标,还与人的许多神经性疾病密切相关。据文献报道氟虫腈等杀虫剂对哺乳动物安全无毒,但在具有高效杀虫活性的同时,对鱼类、蜜蜂等却具有高毒性,说明鱼类GABA受体与哺乳动物存在差异。本文通过分离纯化鱼类的GABA受体,比较了鱼类和哺乳动物两类脊椎动物GABA受体的异同点,这对于筛选高选择性的环境友好型新农药具有相当重要的作用。本文的研究成果如下:第一,本文首次选用我国四大家鱼中养殖规模最大的鳙鱼作为研究对象,比较六种去污剂溶出的GABA受体蛋白浓度,发现1%(V/V)Nonidet P-40溶出的蛋白量最多,达到729.01μg/mL。第二,以环氧基修饰的琼脂糖(Sepharose6B)为基质,偶联经典苯二氮卓类配体Ro7-1986/1,制备了亲和层析介质;并通过硫代硫酸钠滴定法测得琼脂糖上环氧基修饰密度达到66.8μmol/g胶,配体Ro7-1986/1的偶联密度为63.12μmol/g胶。第三,利用制备的亲和柱,结合超滤法,聚乙二醇透析法以及DEAE-sephacel离子交换层析法纯化得到鳙鱼脑中的GABA受体。得到的GABA受体由SDS-PAGE之后得到两条清晰的条带,经Gel-Pro-Analyzer分析软件分析其分子量分别为46KDa和42KDa,可能分别为鳙鱼GABA受体的α和β亚基,与哺乳动物50KDa左右的GABA受体亚基相差不大。并且,我们通过Bradford法测定纯化后受体的浓度为4.6μg/mL。第四,通过异硫氰酸荧光素(FITC)修饰GABA得到荧光配体(FITC-GABA)。测得的FITC-GABA与鳙鱼GABA受体粗提物的解离常数(Kd)和最大结合容量(Bmax)与哺乳动物相比均较高,分别为88.89nM,1.81pM/mg蛋白,说明鱼类GABA受体结合GABA的量更多,但是结合稳定性较低。FITC-GABA与纯化后受体的解离常数(Kd)和最大结合容量(Bmax)分别为13.84nM,824.5pM/mg蛋白。其中,纯化后受体的最大结合容量是粗提物的455倍,证明本实验使用的一系列纯化方法对于分离鳙鱼GABA受体是有效的。研究鳙鱼GABA受体与GABA以及其他药物之间的相互作用对于开发新型高效的农药具有重要意义。
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