胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, App)是一种高度传染性病原菌,能引起猪的出血性、化脓性和纤维素性肺炎。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)可以引起猪肺疫和猪的萎缩性鼻炎。副猪嗜血杆菌(Hamophilus parasuis, Hps)是一种条件致病菌,可以引起猪的纤维素性肺炎,关节炎和脑膜炎。胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌都是猪呼吸道常见的重要致病菌,都可能导致或者继发于其他病原感染,给养猪业造成严重的经济损失。这三种细菌引起的临床症状很难区分,多重感染也给传统的细菌学诊断方法带来困难。因此,本研究建立了一种能够快速诊断鉴别这三种细菌的复合PCR检测方法。PCR检测方法在检测临床样本时,尤其是当多种其他物种的DNA存在时,可能会出现非特异性扩增。当非特异性扩增产物的大小和预计阳性产物大小相似时,就可能发生误判,出现假阳性结果。为了对PCR产物进行定性,提高检测方法的特异性和敏感性,本研究还建立了针对胸膜肺炎放线杆菌的PCR-ELISA检测方法。一、猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌复合PCR检测方法的建立本研究根据胸膜肺炎放线杆菌apxVIA基因序列设计用来检测胸膜肺炎放线杆菌的引物App-Apx-upper和App-Apx-lower。根据多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌16S rRNA基因的种特异性序列设计多杀性巴氏杆菌的特异性下游引物Pm-16S-lower和副猪嗜血杆菌的特异性下游引物Hps-16S-lower。Co-16S-upper和Co-16S-lower根据细菌16S rRNA基因前端和末端的保守区域序列设计,可以和研究中涉及的所有细菌的模板反应,扩增出大小约为1370-1400bp的产物(不同细菌大小略有差异)。Co-16S-upper在复合PCR体系里作为多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的共同上游引物。猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌模板的PCR扩增产物大小分别为342bp、485bp和1258bp。复合PCR对1～12型猪胸膜肺炎放线杆菌标准株,6株多杀性巴氏杆菌标准株,1～15型副猪嗜血杆菌以及25株经生化鉴定确认为上述三种细菌的分离株的基因组DNA作为模板进行检测,均获得预期大小的扩增产物。以猪放线杆菌、吲哚放线杆菌等15种常见细菌作为阴性对照进行PCR检测,结果均为阴性。复合PCR针对胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的敏感性分别为32pg、34pg和67pg。本研究建立的复合PCR检测方法有比较好的特异性和敏感性,可以用于猪胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌的快速检测。二、猪胸膜肺炎放线杆菌PCR-ELISA检测方法的建立本研究的目的是建立具有更高特异性和敏感性的猪胸膜肺炎放线杆菌的诊断方法。所有血清型的猪胸膜肺炎放线杆菌都具有apxVIA基因,并且该基因3’端,5’端和中部的部分区域序列十分保守。本研究通过序列比对,选择保守区域设计引物Apx IV-upper和Apx IV-lower,其中Apx IV-upper的5’端标记生物素。为了对PCR产物进行定性,本研究根据扩增区域内部的序列设计了种特异性探针P1和P2。P1和P2的序列相同,只是P1的5’端标记了地高辛。种特异性的探针以液相杂交的方式检测PCR产物。探针在较高的退火温度条件下仅仅与完全匹配的DNA链杂交,避免了普通PCR可能出现的假阳性结果,提高了检测方法的特异性。PCR-ELISA具有二级信号放大系统,即PCR扩增和ELISA信号放大。本研究建立的PCR-ELISA的敏感性比相同引物的单纯PCR高出约100倍。未经标记的探针P2的作用是对PCR-ELISA检测方法的结果进行质量控制。如果PCR体系里存在胸膜肺炎放线杆菌的DNA并发生特异性扩增,P1就会特异性得与扩增产物杂交,P2的存在会干扰这种杂交,使OD值显著降低。但如果阴性对照也出现类似的OD值的显著降低,则说明出现了非特异性的杂交。