慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是一种起源于多能造血干细胞异常克隆的恶性增生性疾病，约占成年人白血病的20％～30％，年发病率为1／10~5，在我国白血病中发病率仅次于急粒和急淋而居第三位。常见的临床表现为乏力、消瘦、粒细胞异常增高、脾肿大。CML的自然病程一般为3～5年，可分为慢性期(CP)、加速期(AP)和急变期(BC)，晚期70％以上的患者发生急性变或因骨髓纤维化、全身衰竭等原因而死亡。近年来，随着环境污染的加剧以及放射性武器(贫铀弹等)在局部战争中的应用，CML发病率有明显增加之趋势，已日益成为威胁人民健康的一种常见恶性肿瘤。 目前CML尚缺乏可靠的有效治疗，常规化疗很难改变CML的自然病程；α-干扰素也仅能使10％～30％的患者获得短暂的细胞遗传学缓解；异基因骨髓移植(allo-BMT)被认为是目前最有希望治愈CML的方法，但因受患者年龄、供体及移植后严重并发症(GVHD、感染等)等因素的限制，临床上只有20％～30％的患者有可能接受这种治疗；自体骨髓移植(ABMT)相关并发症发生率低， MAPK庄馒殁傲纫懈方血请烊号爹导呻矽形展及算形用硼理研究不受年龄限制，但由于缺乏有效的骨髓净化措施，移植后复发率高；近两年来发展起来的BCR／ABL酪氨酸激酶抑制剂STI571被认为是治疗CML的革命性的分子靶向药物，但由于臼血病细胞迅速产生的耐药性、停药后易复发等，使其应用受到限制。因此急需积极探求治疗CML的新方法。 CML具特征性的Ph染色体，由其形成的bcr－abl融合基因在CML的发病中起重要作用。近年来，随着免疫学、分于生物学研究的进步和发展，CML己成为迄今发病机制研究最透彻的白血病分于模型，这使CML获得了发展合理分于治疗的良好机会。从分于机理针对CML发病的各个关键环节，研究靶向治疗药物，发展特异性疗法，彻底消灭骨髓中的白血病克隆，己成为当今CML治疗研究的热点。 信号转导是指细胞感知胞外刺激后，通过细胞内信号分子的逐级传递作用，最终诱导产生一系列的细胞质、细胞核内事件和各种生理生化反应的过程。信号转导在生物体内普遍存在，介导多种细胞生物学效应。近几年，国内外对细胞信号转导途径的研究取得了很大进展，很多疾病的发生都与异常和（或）错误的信号转导有关，从理论上讲，阻断其异常和（或）错误的信号转导就有可能阻止疾病的发生、发展，所以从信号转导通路入手来研究疾病的防治策略己越来越引起人们的广泛重视。 CML的PZ10蛋白具有异常增高的PTK活性，它可诱发多条信号转导途径的异常激活，起主要作用的有促进细胞增殖并调节基因转录的Ras－MAPK途径和调节效应基因转录的JAK－STAT途径，其中MAPK级联反应是这两条信号转导途径的最后共同通路，它处于关键位置，是CML发病的主要信号转导通路。可见Ras－MAPK信号通路和CML的发生有密切关系，有关Ras－MAPK信号通路在CML发病中作用的研究，国内外尚未见报道。 本研究以CML细胞Ras－MAPK信号转导通路中的MAPK为靶点，应用反义技术，以阳离子脂质体作为转染载体，设计并合成了与mapk mRNA翻译起始部位的 17个碱基序列互补的反义寡核昔酸（mapk ASO人联合her／abl反义第四军医大学博士学位论文 博士研究生：尚振川（2003）导师：孙秉中教授5 MAPK ＄Mop＄血疗烊号奔导中肘炉贤及算浓凤挑理殿钴寡核甘’酸（bCI、／fbi ASO）作用于 CML细胞系 KS62和体外培养的原代 CML骨髓纠1胞，沤过封闭伙·巾！和mapk基因的表达以在不同环节作用于CML细胞，惜助MTT、勺－TdR掺入、集落形成、蛋白合成、Y二’P掺入、免疫印迹、RTPCR、电镜、流式细胞仪、片段DNA含量检测和DNA ＋J状电泳等试验和手段，从不同角度，采用多项指标，在细胞、蛋白及分子水平上系统探讨了MAPK在CML发病。。【I的作用、作用机理及其与h人aM融合基因的关系。结果表明： 1、Y／中掺入法和 FCM测得 KS62细胞 MAPK活性和 MAPK蛋白表达分别比正常健康人骨髓细胞高2．4倍和5．4倍。 人作用 48 h，2 v mol／L的 mapk基因反义寡核昔酸对 K562细胞增殖、集落形成、蛋白和 DNA合成的抑制率分别为 64．2o、36．lo、40．3O吞 40．5O，her／abl基因反义寡核昔酸的抑制率分别为sl．8％、46．IO／O、43．2％和57．1％。 3、2 n mol几的 mapk基因反义寡核昔酸作用 KS62细胞 48h，其对 KS62细胞 MAPK M性、MAPK蛋白表达和 MAPK蛋白含量的抑制率分别为 39．3O。34．Zo／o和 32．6o，her／abl基因反义寡核昔酸的抑制率分别为 44．9O、36．3o和36．7％。 4、RTPCR检测结果表明，her／abl基因反义寡核苦酸可以抑制her／abl融合基因表达，表现为特异性扩增带荧光亮度变弱，紫外分光光度计测得其抑制率为 63．4％；而 Inapk基因反义寡核苦酸对 her／abl融合基因表达的抑制率仅为2．IO／O。 5、2 n mol／L的 mapk基因反义寡核昔酸和 her／abl基因反义寡核昔酸作用K562细胞 48 h，电镜和FCM均检测到细胞发生凋亡，凋亡细胞比率分别为