研究背景:TNF-α主要是由激活的巨噬细胞、单核细胞产生的233个氨基酸的细胞因子,在固有免疫和炎症反应中发挥多种重要作用,可在响应感染和/或炎症刺激、启动对病原体的免疫中起关键作用。TNF-α是一种主要的促炎细胞因子,TNF-α的过量产生,可以引起类风湿关节炎、强制性脊柱炎、炎症性肠病等多种疾病的发生。TNF-α产生时,首先被转运到细胞膜,表达为膜相关的三聚体。膜TNF-α随后可被TNF-α转化酶（TACE）裂解,并以三聚体形式进入循环。膜结合形式（mTNF-α）或可溶性形式（sTNF-α）均具有生物学活性。TNF-α受体包括两种,TNF受体1（TNFR1）是55 kDa的蛋白质,TNFR2是75 kDa的蛋白质。两种受体的分布有所不同,TNFR1普遍存在,TNFR2局限表达在某些细胞（尤其是免疫细胞）。另外,TNFR1可以由膜形式和可溶形式的TNF-α激活,多数报道表明TNFR2仅被膜形式有效激活。TNF-α可调节多种炎症和自身免疫过程,它是一种多效细胞因子,参与细胞凋亡、分化和细胞募集。TNF-α和TNFR-1结合,在激活和招募免疫细胞进而引起炎症上发挥重要作用,TNF-α可激活转录途径、诱导氧化应激,氧化应激进而和炎症相互影响,促进细胞降解[1]。在大多数自身免疫性炎性疾病中,疾病发生与TNF-α过量产生有关。使用TNF-α生物抑制剂治疗时,患有RA、溃疡性结肠炎、克罗恩病、牛皮癣、牛皮癣性关节炎、强直性脊柱炎、青年特发性关节炎（JIA）的病人的大多数病症得到了改善。在过去的几十年中,针对已经进行了各种临床试验,这些试验显示TNF-α拮抗剂可改善RA患者的临床症状[2]。这些TNF-α拮抗剂,包括英夫利息单抗、赛妥珠单抗、依那西普、戈利木单抗、阿达木单抗,已经彻底改变了自身免疫性疾病,特别是风湿性炎性疾病的治疗方案。这些药物与TNF-α二聚体结合形成复合物,从而阻碍TNF-α受体的结合,进而阻止了诱导炎症和其他信号通路的下游通路的活化。然而,迄今为止报道的药物是蛋白质或抗体,具有较高的分子量,并与各种副作用相关,例如,引起结核病、充血性心力衰竭、狼疮、脱髓鞘疾病、注射部位反应、自身抗体的产生和系统性副作用,以及其制作成本高的缺点,大大降低了生物制剂在临床的治疗效果。显然,具有抗TNF生物制剂功效的小分子药物可让更多患者受益。目的:1.制备及表征包载TNF-α小分子抑制剂C87的纳米粒子。2.在L929细胞中,分析C87 NP拮抗TNF细胞毒性的作用。3.在小鼠自身免疫性肝损伤模型中,评价C87NP抑制TNF-α细胞毒性的作用。4.评价C87在类风湿关节炎疾病模型的治疗效果。方法:1.采用纳米沉淀法制备载C87的纳米粒子（C87NP）,并对其理化性质及体外释放行为进行表征。2.在L929细胞中用MTT法分析C87NP拮抗TNF-α细胞毒作用的效果。3.刀豆蛋白A（ConA）尾静脉注射诱导小鼠自身免疫性肝损伤,C87NP预给药防治小鼠自身免疫性肝损伤。4.使用LEGENDplexTM分析小鼠血清中13种炎症因子、趋化因子、生长因子表达水平。5.流式细胞术分析肝和脾中T细胞及亚群、NK细胞等的分布、比例和数量。6.通过构建胶原诱导类风湿关节炎小鼠模型,观察小鼠足爪肿胀程度,小鼠关节炎严重程度评分,小鼠足爪Micro-CT分析,小鼠足爪病理HE染色。结果:1.制备出的C87NP具有较高载药量（34.4%）,且稳定性好,其包封率为48.1%,C87NP平均粒径为82.57nm,多分散系数为0.115,呈电中性,透射电镜结果显示其为球形结构;该纳米粒子可在体外持续缓慢释放C87,持续时间不少于8小时。2.C87 NP可以在体外抑制TNFα对L929细胞的杀伤（IC50=9.13 μmol/L）,并呈现浓度依赖性关系。3.自身免疫性肝炎动物实验结果显示,C87 NP治疗组小鼠的存活率为66.7%,进一步的生化和病理分析结果表明:ConA小鼠尾静脉给药12小时后,C87NP预防性给药能显著降低血清中ALT、AST与部分细胞因子的水平（P<0.01）,减轻肝损伤,减少CD4+T、CD8+T、NK细胞等对肝脾的浸润（P<0.01）,提高脾脏Treg细胞比例（P<0.05）。4.C87治疗可显著降低小鼠胶原诱导关节炎（CIA）关节炎评分（P<0.05）,可缓解关节骨侵蚀和关节炎性细胞浸润。结论:1.成功制备出纳米药物C87NP,具有缓释、长效的特点。2.C87NP在体内外具有良好的抑制TNF-α细胞毒性的作用,这为其在今后临床上的应用奠定了基础。3.C87可有效缓解小鼠关节炎疾病模型严重程度。