【摘 要】
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目的:随着糖尿病发病率的不断攀升,糖尿病视网膜病变的发病率也逐步上升;此外,在积极治疗和优质护理的帮助下,越来越多的糖尿病患者寿命延长,导致患有糖尿病视网膜病变的人数不断增加。目前对于糖尿病视网膜病变的治疗措施有限,因此,对糖尿病患者进行早期准确的识别、预测与干预以延缓糖尿病视网膜病变的发生发展至关重要。本课题旨在探索糖尿病视网膜病变患者外周血外泌体miRNA作为生物标志物的可能性,同时探索外泌体
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目的:随着糖尿病发病率的不断攀升,糖尿病视网膜病变的发病率也逐步上升;此外,在积极治疗和优质护理的帮助下,越来越多的糖尿病患者寿命延长,导致患有糖尿病视网膜病变的人数不断增加。目前对于糖尿病视网膜病变的治疗措施有限,因此,对糖尿病患者进行早期准确的识别、预测与干预以延缓糖尿病视网膜病变的发生发展至关重要。本课题旨在探索糖尿病视网膜病变患者外周血外泌体miRNA作为生物标志物的可能性,同时探索外泌体miRNA在糖尿病视网膜病变中发挥的作用。方法:1.血样标本的收集:选取武汉协和医院内分泌科2020年9月至2021年1月入院的符合标准的糖尿病患者,使用医用真空采血管进行采血,随后静置、离心、吸取上清淡黄色血清,血清冻存后准备后续实验。2.采用国际上提取外泌体的“金标准”超速离心法提取血清外泌体,随后对血清外泌体进行鉴定以及外泌体miRNA测序。3.使用R4.0.3软件对测序结果进行基因富集分析、GO分析、KEGG通路分析以及对差异miRNA进行靶基因预测。4.使用R4.0.3软件对血清外泌体差异miRNA与临床指标的相关性进行统计学分析。5.经过逆转录和cDNA扩增后,采用实时荧光定量PCR（q PCR）对差异miRNA进行检测和验证,同时检测差异miRNA的表达量在全血中是否发生改变。结果:1.本实验共收取血清样品18例,其中糖尿病患者不伴有视网膜病变9例（DM组）,糖尿病患者伴视网膜病变9例（DR组）,将收集的血清经过超速离心提取外泌体后,其产物经过NTA、TEM、WB鉴定,透射电子显微镜下可见杯托状或球形（cup-or sphere-shaped morphology）外观,NTA结果提示循环纳米颗粒大小基本处于30-200nm的分布范围,平均粒径为140nm。WB结果显示在外泌体样品中均检测到CD9、CD63和TSG101三种特异性标志物。结果证实分离的循环纳米颗粒为外泌体。2.以DM组为对照组,DR组为实验组,将提取的外泌体进行miRNA测序,包括已知和未知的miRNA,共筛选出1059条miRNA结果,其中有统计学意义的有18个,表达均上调。3.对筛选得到的外泌体miRNA进行基因富集分析、KEGG、GO等,预测其参与到的生物学功能以及富集的信号通路,结果表明DR组中表达差异显著的外泌体miRNAs所靶向的基因参与的生物学过程类别主要富集在信号转导、转录的调控等;细胞组分类别中主要富集在膜、细胞质等;在分子功能的类别中,靶基因主要富集于蛋白结合、金属离子结合等。同时KEGG共得到268条相关通路的信息,其中48条有统计学意义。随后对差异miRNA miR-3976-p3进行靶基因预测,并将miR-3976-p3靶基因富集性分析结果中显著性最高的miRNA:m RNA对构成的网络图。4.经qPCR验证后,筛选出的外泌体差异miRNA在全血中并没有表现出显著差异,而血清外泌体miRNA在DR组显著高于DM组。5.我们采用皮尔森相关系数检验探究研究人群中外泌体差异miRNA的表达与临床参数的相关性,结果显示DR患者miR-3976-p3的表达量与HDL水平呈显著负相关,DR组中pc-5p-39533的表达量与身高显著相关。结论:1.与DM组相比,DR组血清外泌体miRNA表达谱发生改变,而非全血miRNA显著升高。2.miR-3976-p3、PC-5p-39533、PC-3p-37421在糖尿病视网膜病变的发生发展中可能扮演一定的角色,并有作为糖尿病视网膜病变生物标志物的潜力。3.2型糖尿病患者低HDL水平或较差的胰岛功能可能是发生糖尿病视网膜病变的危险因素。
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