生物活性蛋白或活性肽是一类具有增强免疫力、抗氧化、抗疲劳、辅助降血压等功能的重要活性物质。研究发现,不同蛋白酶酶解同一蛋白源后所得的生物活性肽往往具有不同的生物活性,其中经胃蛋白酶酶解后的多肽往往具备较好的增强免疫力效果。此外,同一蛋白酶酶解后的不同分子量大小的多肽具备的生物活性效果也不相同。小球藻中蛋白质含量约占干重的50%,具有抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、降血脂以及增强免疫力等生物活性,这些功能必定与小球藻所含的蛋白质和多肽密切相关。但是,目前关于小球藻多肽增强免疫力的功能研究,包括小球藻经何种蛋白酶酶解后的多肽具有较好的增强免疫力活性,以及哪个分子量区间的酶解多肽具有最佳的增强免疫力效果都还没有相关报道。因此,本文通过高压均质法联合纤维素酶和果胶酶复合酶解,提取小球藻蛋白质;经胃蛋白酶酶解小球藻蛋白质,并采用响应面法优化酶解条件;利用多级膜分离技术制备不同分子量区间的小球藻多肽;体外以RAW264.7细胞为细胞模型,并且通过动物实验,筛选增强免疫力效果最佳的小球藻多肽区间。研究结果如下:(1)采用高压均质法破碎小球藻细胞壁,确定了高压均质的最佳参数为:藻液浓度为15%、均质压力40 MPa、均质次数2次。此时小球藻细胞破壁率可达98%以上,蛋白质浓度为16.55 mg/mL,占小球藻干重的11.03%。(2)通过正交实验确定了纤维素酶和果胶酶复合酶解破壁液的最佳参数为:按每g藻粉加入10000 U:8000 U的纤维素酶和果胶酶,pH 4.0,酶解温度55℃,酶解时间5 h。此时蛋白质浓度为21.85 mg/mL,占小球藻干重的14.57%,相比均质后小球藻蛋白质占干重的11.03%,提取效率提高了 24.3%。后续通过离心、浓缩、低温冷冻干燥等实验技术制备小球藻蛋白质粉末。(3)利用响应面实验确定了胃蛋白酶酶解的最佳参数为:底物浓度50 g/L、加酶量1778 U/g、pH 2.2、酶解温度44.4℃、酶解时间3.4 h,此时小球藻蛋白质的水解度为54.94%。(4)联合多级膜分离技术,即利用不同孔径的超滤膜分离并制备不同分子量区间的小球多肽,后续通过低温冷冻干燥制备不同分子量区间的小球藻多肽粉末。(5)以RAW264.7细胞为细胞模型,检测经不同分子量区间的小球藻多肽刺激后,对其增殖、吞噬能力和细胞形态的影响。发现:分子量区间为0～1 kDa的小球藻多肽对RAW264.7细胞的增殖和吞噬能力具有最显著的促进效果;同时经不同分子量区间的小球藻多肽刺激RAW264.7细胞后,均会使原本光滑圆润的细胞呈现出不规则的形状,且伸出伪足。(6)通过DNFB诱导小鼠迟发型变态反应实验,发现给予分子量区间为0～1 kDa多肽的小鼠左右耳片重量之差与阴性对照组相比,具有显著性差异其(P<0.001),表明该分子量区间的小球藻多肽具有促进小鼠迟发型变态反应的作用;通过ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验,发现给予分子量区间为0～1 kDa和3.5～5 kDa多肽的小鼠淋巴细胞转化能力与阴性对照组相比,具有显著性差异(P<0.01),表明该分子量区间的小球藻多肽具有促进小鼠的淋巴细胞增殖、转化的作用。综上所述,发现分子量区间为0～1 kDa的小球藻多肽具有最佳的增强免疫力效果。