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目的：确认体外诱导培养不同活化状态巨噬细胞的表型特征；探讨其条件培养液对7721肝癌细胞(SMMC7721)增殖和迁移的影响；比较分析和筛选不同活化状态巨噬细胞外分泌差异蛋白并进行表达验证,为肝癌的临床免疫治疗提供新的角度和思路。方法：采用PMA诱导人单核白血病细胞THP-1使其分化成巨噬细胞(UaM),再分别用LPS诱导培养出经典活化的巨噬细胞(M1),IL-4和IL-13共同诱导培养出选择性活化的巨噬细胞(M2)。采用FCM检测不同活化状态巨噬细胞表面CD163的表达；运用ELISA法检测不同活化状态巨噬细胞IL-10和IL-12的分泌水平；利用RT-PCR检测不同活化状态巨噬细胞TNF-α, CCL3, iNOS, AMAC-1, Arg-1, CCL22等基因片段的相对表达含量；CCK-8法检测不同活化状态巨噬细胞条件培养液对SMMC7721的增殖活力;Transwell迁移试验检测不同活化状态巨噬细胞培养液对SMMC7721迁移能力的影响；运用iTRAQ为基础的定量蛋白质组学技术比较分析和筛选不同活化状态巨噬细胞外分泌蛋白中的差异蛋白；应用Western-Blot免疫印迹法对差异蛋白GSN、QSOX1和CD14在质谱中的检测结果进行蛋白水平的验证。结果：1.不同活化状态巨噬细胞的鉴定1)CD163在诱导培养出的M1、M2和UaM三种细胞中的表达率分别为5.32±0.53%,12.75±0.82%%,9.30±1.15%。经统计学分析显示,CD163的表达率在M1、M2和UaM细胞表面均存在差异(P<0.05),且在M2中的表达量最高,M1细胞的表达量最低。与CD163为M2表面标志物的报道相符。2)诱导培养出的M1, M2, UaM培养液中,IL-10的分泌水平分别为(16.73±3.59) ng/L、(26.26±2.66) ng/L、(18.23±1.76) ng/L, IL-12的分泌水平分别为(8.17±0.97) ng/L、(4.08±0.64) ng/L、(4.31±0.72) ng/L。单因素方差分析显示,M1细胞培养液中的IL-12分泌量高于UaM和M2(P<0.01),M1细胞培养液的IL-10分泌量则低于UaM和M2(P<0.01),在UaM和M2细胞培养液中IL-12(P=0.558)和IL-10(P=0.265)两者的分泌量均无统计学差异。符合M1有高IL-12,而M2巨噬细胞细胞,有低IL-12和高IL-10的特点。3)诱导培养出的UaM、M1和M2中各基因表达的检测结果经统计学分析显示,M1中TNF-α (P<0.01)、CCL3(P<0.01)和iNOS(P<0.01)的相对表达量均高于M2,而在M2中AMAC-1(P<0.05)、CCL22(P<0.05)和Arg-1(P<0.01)的相对表达量则显著高于M1。2.不同活化状态巨噬细胞条件培养液对SMMC7721增殖和迁移的影响1)随培养液中M1条件培养液比例的增高,SMMC7721的增殖活力逐渐降低；然而M2条件培养液则随其比例的增高而使SMMC7721增殖活力增高。各个不同比例组M1条件培养液对SMMC7721的增殖活力均明显低于UaM组和M2组(P<0.05)。UaM和M2的条件培养液在比例为1：1时对SMMC7721的增殖活力无统计学差异(P=0.293),但在其他比例组均存在统计学差异。2)在细胞运动试验中,空白对照组、M1条件培养液+SMMC7721组、M2条件培养液+SMMC7721组和UaM条件培养液+SMMC7721组穿过Transwell基底膜的细胞数量分别为(153.40±19.12)、(99.80±18.82)、(274.40±3.22)和(209.60±25.67)。M1条件培养液+7721组穿过transwell基底膜的细胞数量最少,M2条件培养液+7721组穿过transwell基底膜的细胞数量最多；不同活化状态的巨噬细胞条件培养液对SMMC7721穿过Transwell基底膜的细胞数量均存在差异(P<0.01)。3.不同活化状态巨噬细胞外分泌差异蛋白的筛选及验证1)在两次生物学重复实验中,不同活化状态巨噬细胞外分泌液共鉴定出1694个蛋白(95%可信度)。置信(Cutoff)条件值为ProtScore(unused)>1.5,Confidence Interval>95%并满足EF<2且P<0.05,鉴定到的蛋白数量分别为854和1464个。按照临近时间点蛋白比值Ratio>1.2(上调)或Ratio<0.80(下调)标准筛选,共有289个含定量信息的差异表达蛋白。其中表达上调1.2倍以上蛋白254个,表达下调0.8倍以下蛋白共35个。2)免疫印迹验证显示,GSN、QSOX1和CD14在不同活化状态巨噬细胞外分泌液中存在差异,GSN与QSOX1在M2分泌液中上调,CD14在M2分泌液中下调。结论：1.在体外成功诱导产生了具有典型表型特征的M1和M2两类巨噬细胞亚群。2.M1条件培养液能有效地抑制SMMC7721的增殖和迁移,发挥抑制肿瘤的作用；M2条件培养液则可以促进SMMC7721的增殖和迁移,有助于肿瘤的发展。3.不同活化状态巨噬细胞外分泌液中差异蛋白的筛选及其表达趋势与质谱鉴定结果相一致。