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蛋白质糖基化是生命体最重要的翻译后修饰之一,糖蛋白几乎参与了所有重要的生命过程。蛋白质糖基化主要常见的类型有N-糖基化和O-糖基化。糖基化的修饰情况与蛋白质本身和外部客观环境紧密相关,本论文致力于发展不同生物样本的糖基化修饰分析方法,针对血浆中的唾液酸化糖肽、内源性糖基化肽段以及尿液外泌体的提取、富集及鉴定等问题展开工作,实现了对血清唾液酸糖肽的特异性富集鉴定、血浆内源性完整N/O-糖基化肽段首次大规模鉴定分析,建立了尿液外泌体与血浆外泌体蛋白之间的相关性,并将其应用于临床肝癌患者的样品分析。针对血清中唾液酸糖基化修饰丰度低和富集特异性低的问题,我们发展了一种多组氨酸修饰的聚合物微球,利用其具有的静电作用、亲水作用以及多组氨酸之间的协同作用,可以实现对唾液酸糖基化肽段的特异性富集,并成功从4mL人源血清样品中富集到510条完整糖基化肽段,其中唾液酸化糖基化肽段的特异性高达94.7%,实现了复杂生物样本中唾液酸糖基化修饰的特异性富集和分析。针对人源血清中的内源性糖基化肽段的低丰度以及难鉴定的问题,我们发展了一种利用酸热和超滤的方法提取内源性肽段,再利用亲水相互作用实现对糖基化肽段的高效富集。并利用“twin spectra scheme”和理论去糖的策略,分别实现对非特异性酶切的223条内源性完整N-糖基化肽段和51条内源性完整O-糖基化肽段的有效鉴定。实现了对血清样品中的内源性完整N-糖基化肽段和内源性完整O-糖基化肽段的首次分析。利用定量蛋白质组学技术,建立人源尿液和血浆的外泌体蛋白表达上的相关性,结合临床上肝癌患者的尿液和血浆,获得肝癌患者尿液和血浆外泌体中发生上调和下调的蛋白,通过比对不同来源生物样本之间的差异变化,共获得67个蛋白在尿液和血浆外泌体之间存在明显差异,并且具有相同或相反的丰度变化,其中包括如可调控肝癌细胞中癌基因c-Myc表达的激酶LYN,充分说明尿液外泌体蛋白与血浆外泌体蛋白之间确实存在一种相关性,为肝癌甚至其他疾病的检测诊断提供新思路。同时,利用定量糖基化蛋白质组学技术,进一步对肝癌患者尿液外泌体糖基化进行定量分析,从具有差异的完整糖肽的角度在患者尿液外泌体糖蛋白中得到81个表达量上调和103个表达量下调的完整糖肽,共计对应90个差异糖蛋白,其中39个糖蛋白在全蛋白定量分析时均不具有显著性差异。因此,我们利用糖基化蛋白质组定量分析,为全蛋白组定量数据进行了补充,也为肝癌患者的临床诊断和机制探究提供更多的理论支撑。综上,本文根据不同生物样品的特征,发展了针对不同生物样品蛋白质组和糖基化蛋白质组研究的方法。实验证明,利用唾液酸糖肽带负电荷的特征,发展了多组氨酸修饰微球MHM实现了对血清中唾液酸糖肽的特异性富集;利用内源性糖肽的低分子量特征,发展了将酸热变性和超滤集成为一体的提取方法,并利用“twin spectra scheme”和理论去糖策略实现内源性糖肽的有效鉴定;利用外泌体的亲脂性,采用EVTRAP磁珠建立肝癌患者尿液和血浆之间的外泌体蛋白质组的相关性,并采用定量糖基化蛋白质组技术从完整糖肽的角度进一步补充分析。这些针对不同生物样品的蛋白质组和糖基化蛋白质组研究策略,从蛋白质组学的角度为临床疾病的发生发展提供更多方法和数据支撑。