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纤维素是自然界储量非常丰富、分布非常广泛的一类天然多糖大分子,具有价格低廉、原料易获取、资源可再生以及对环境友好等特性。工业应用纤维素为原料生产生物乙醇是开发新能源,缓解能源危机的一种有效手段,也是世界各国目前的研究热点之一。如何提高纤维素利用率是目前亟待解决的问题。本研究基于实验室之前的研究工作成果,以组成型启动子序列替换整合型分泌表达载体pHBM368的诱导型启动子序列,构建得到载体pHBM368-pgk,然后将异源的纤维素外切葡聚糖酶基因(cbh,GeneBank:AY861348)、纤维素内切葡聚糖酶基因(eg,GeneBank:EU169241)和纤维素β-葡萄糖苷酶基因(bg, GeneBank:AF163097)分别与pPIC9K的信号肽编码序列连接,再分别与替换启动子后的整合型表达载体pHBM368-pgk连接,获得阳性克隆,通过电转化法将线性化的重组质粒DNA分别转化进营养缺陷型酿酒酵母INVSc。经过营养缺陷的筛选平板筛选得到分别整合三种纤维素酶基因的重组酵母(INVSc-P-SE,整合内切葡聚糖酶基因eg;INVSc-P-SC,整合外切葡聚糖酶基因cbh；INVSc-P-SB,整合p-葡萄糖苷酶基因bg),通过刚果红染色法功能筛选得到分别具有外切葡聚糖酶活性和内切葡聚糖酶活性的菌株,由于羧甲基纤维素不是p-葡萄糖苷酶的最佳底物,功能筛选过程中INVSc-P-SB周围没有出现明显水解圈。根据DNS法测定结果推算,在50℃反应条件下,每毫升粗酶液中β-葡萄糖苷酶、外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的酶活分别为45.22U/mL、72.11U/mL和75.45U/mL。发酵选择微晶纤维素作为唯一碳源,旨在确定重组酵母在仅含有纤维素碳源的条件下能否生长,组成型强启动子是否有利于纤维素酶基因的表达。发酵过程采用同步糖化发酵法,持续84小时。单一菌株发酵生物量的变化趋势显示,INVSc-P-SE在24h左右进入稳定期,且稳定期持续时间较长,生长状况最好;INVSc-P-SC也能在24h左右进入稳定期,但持续时间较短,且生长状况低于INVSc-P-SE;INVSc-P-SB在48h左右进入稳定期,生长状况低于前两者；混合菌株发酵结果显示,其生物量要高于任意单一菌株发酵的生物量。实验结果表明,在1L摇瓶发酵中,重组酵母能够利用唯一碳源微晶纤维素生长；从生物量变化的趋势上看,混合菌发酵提升纤维素酶水解效率对纤维素酶协同作用的机制提供了佐证；根据与实验室之前工作成果相比得出结论,组成型启动子较诱导型启动子更有利于外源基因的高效表达。总体来说：构建的重组酵母能有效直接利用纤维素碳源,为工业应用纤维素高效生产乙醇奠定了基础。