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乳腺上皮细胞实现泌乳分化的过程中,催乳素(prolactin,PRL)激活的泌乳信号和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用都是必不可少的。层粘连蛋白(laminin,LN)作为基底膜主要成分,能够与其细胞膜表面的黏附受体整联蛋白相互作用,调控血管生成和蛋白酶活性,并与器官发育、蛋白合成、脂肪分化等多种生命活动有关。研究表明,层粘连蛋白能够促进催乳素参与泌乳信号通路的持续激活,并在体外三维培养情况下促进小鼠乳脂的分泌,然而层粘连蛋白调控奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)泌乳分化的分子机制尚不清楚。本研究以中国荷斯坦奶牛泌乳期乳腺组织和经原代培养获得的八代以内DCMECs为实验材料。首先,应用激光共聚焦荧光显微镜和超高分辨显微镜观察DCMECs的分子标志CK18、β-酪蛋白以及LN细胞表面受体β1整联蛋白和PRLR的组织细胞定位。然后,以基底膜主要成分LN、非细胞外基质成分BSA(阴性对照)、无包被塑料培养板(空白对照)和基膜类似物Matrigel(阳性对照)作为培养底物,添加分化培养液(氢化可的松+胰岛素+催乳素)诱导细胞泌乳分化。应用透射电镜观察细胞在不同培养底物下的细胞超微结构;免疫荧光显微镜检测了LN对于细胞内脂滴形成即乳脂合成的影响;RT-q PCR和Western blotting检测了几种主要乳蛋白成分,泌乳分化正向调控关键信号通路关键信号分子,以及负向调控因素STAT3、SOCS3、CIS、PTEN的表达;酶联免疫(ELISA)试剂盒检测培养液中β-酪蛋白分泌和乳脂分泌的情况。Co-IP和质谱联用检测了β1整联蛋白异二聚体的类型及其互作蛋白,GO分析归类差异互作蛋白功能并筛选出了更多可能参与泌乳调控的候选蛋白。研究结果如下:(1)经原代细胞的分离纯化获得的DCMECs具备腔上皮细胞特异性分子标志角蛋白18;细胞内检测到泌乳分化特异性分子标志β-酪蛋白。(2)免疫荧光观察发现β1整联蛋白在细胞基底侧极性定位且不依赖于细胞外基质底物的存在,PRLR表达弱阳性,泌乳末期或干(断)乳导致乳腺退化时这些PRLR细胞可能脱落到腺泡腔内;透射电镜观察细胞超微结构表现为细胞核沉降基底侧,分泌囊泡大量增多,由细胞基底侧向远离细胞核的顶侧定向分布,囊泡内含蛋白胶束,表明获得了具有泌乳分化特性的奶牛乳腺上皮细胞,且相对于未包被塑料培养板和BSA组,Matrigel和LN组超微结构的泌乳分化特征更为明显。(3)Co-IP和质谱联用检测不同底物包被组β1整联蛋白异二聚体类型及其互作蛋白,并通过GO分析对差异互作蛋白的定位、功能以及参与的信号通路进行统计归类。结果显示α2亚基与β1亚基共存于同一蛋白复合物,而未筛选到其他符合条件的α亚基,提示α2β1异二聚体至少是DCMECs中β1整联蛋白的一种主要存在形式。β1整联蛋白互作蛋白主要分布在细胞膜,细胞外和细胞骨架。与BSA组相比,LN组和Matrigel组蛋白在细胞膜和细胞外的数量上差异较大,功能上涉及黏附连接,肌动蛋白细胞骨架,微丝运动,蛋白动力复合物,介导囊泡的运输,线粒体ATP跨膜转运和脂质的生物合成,参与细胞黏附。部分差异互作蛋白参与整联蛋白信号通路。(4)在HIP分化培养液的诱导下,LN组与无包被培养板和BSA组相比,ITGB1(整联蛋白β1亚基编码基因)和ILK m RNA和蛋白水平都显著上升,Rac1蛋白水平显著升高;PRL/PRLR-STAT5信号通路中PRLR、STAT5a、STAT5b m RNA水平显著升高,PRLR、pSTAT5蛋白水平显著升高,STAT5蛋白水平无显著变化;β-酪蛋白、κ-酪蛋白的编码基因CSN2、CSN3 m RNA水平显著升高,β-酪蛋白表达量也显著升高。这些实验结果表明LN能够正向促进β1整联蛋白-ILK-Rac1和PRL/PRLR-STAT5信号通路中关键信号分子的表达,进而促进β-酪蛋白和其他乳蛋白的转录和翻译。(5)在HIP分化培养液诱导泌乳分化时,LN组与无包被培养板和BSA组相比,能够抑制PRL/PRLR-STAT5信号通路中关键负调控因子CIS以及STAT5候选竞争者STAT3的基因表达;LN联合PRL刺激增加了STAT5活化也引起了STATs家族反馈抑制因子SOCS3基因表达水平显著上升,因为SOCS3与STAT3之间有明确的拮抗关系,SOCS3表达上调可以降低STAT3活化水平,有利于STAT5活化。对PI3K-AKT-m TOR信号通路的关键负调控因子PTEN无显著影响,表明LN主要作用于PRL/PRLR-STAT5信号通路。(6)在HIP分化培养液诱导泌乳分化时,LN组与普通塑料培养板和BSA组相比,DCMECs内的脂滴数量更多,脂质合成更活跃,但在培养液中检测甘油三酯并无显著变化,表明LN促进了细胞内脂质合成,但是未影响乳脂分泌。综上所述,在DCMECs中,基底膜的主要细胞外基质成分LN作为培养底物显著改变细胞超微结构,促进细胞内的乳脂乳蛋白合成;LN细胞表面受体β1整联蛋白异二聚体(α2β1是一种主要形式)能介导细胞-LN黏附,与大量涉及细胞定位、生物过程、信号通路的蛋白质形成蛋白复合物,构建了一个细胞内外信号交流平台。LN作为培养底物上调了其受体的β1整联蛋白-ILK-Rac1信号通路,同时增加PRL/PRLR-STAT5活性;LN作为底物,既减少与STAT5活化有竞争关系的STAT3基因表达,又协助PRL诱导STATs负反馈因子SOCS3表达上调有利于拮抗STAT3活性;同时,LN减少了能够抑制STAT5活化的负调控因子CIS表达水平。总之,LN全面促进了DCMECs泌乳功能性分化,有利于β-酪蛋白和乳脂合成,但未显著影响β-酪蛋白和乳脂的分泌。