[研究背景]急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征(Acute Lung Injury/Acute Respiratory Distress Syndrome,ALI/ARDS)是指由于肺内外的各种致伤因素导致肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,出现进行性呼吸困难和顽固性低氧血症为特征的机体过度炎症反应综合征。其中ARDS是ALI的一种严重形式,在世界范围内发病率及死亡率均较高,是ICU患者死亡的主要原因之一。ALI/ARDS的特征是严重肺部炎症,引起肺泡-血管内皮屏障的破坏,导致大量中性粒细胞和其他炎性细胞涌入,炎性细胞因子和炎性介质释放,富含蛋白质的液体引起肺泡充血、表面活性物质合成和代谢障碍以及局部高凝状态。这些病理因素共同损害了肺的气体交换和肺泡表面功能,患者出现严重的低氧血症和肺动脉楔压升高。ALI病因复杂,经过半个世纪,有关ALI/ARDS的发病机制的研究已取得长足进展,但对于ALI的确切发病机制尚未完全阐明。目前的研究普遍认识到,肺内炎性细胞过度活化、募集,大量的炎性因子和效应细胞相互激活,相互作用,引起的失控性炎症反应是ALI的主要病理生理变化。因此,抑制失控性炎症反应可能是治疗ALI的关键途径。过去几十年有关ALI/ARDS的研究多集中在探讨细胞因子网络失衡,观察各种细胞因子拮抗剂在ALI/ARDS中的临床疗效,但始终没有取得重大突破和进展。近几年,细胞信号传导的分子机制及基因调控逐渐成为研究热点,大量实验表明,炎症细胞内各促炎信号通路紊乱在ALI/ARDS发病机制中具有重要作用。因此探索调控急性肺损伤中各种促炎信号通路的机制,对疾病进行早期诊断和治疗,及时逆转不良的预后具有非常重要的临床意义。近期的研究发现,Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是革兰阴性菌中脂多糖(LPS)感染细胞的信号转导模式识别受体,介导了核转录因子κB(NF-κB)的活化和炎性介质的生成,是细胞信号转导中最早的信号分子之一。众多研究认为,TLR4/NF-κB通路在LPS所致的急性肺损伤中能够快速启动细胞内炎性信号传导通路。在TLR4与LPS结合后,经过激活多种信号途径,其中主要为髓样分化因子 88(myeloid differentiation factor88,MyD88)途径,经过逐级传递信号,激活IκB激酶(IKK),随后NF-κB抑制因子(inhibitor of NF-κB,IκB)磷酸化,IκB从NF-κB上脱落并被泛素化,NF-κB由抑制状态被激活。激活后的NF-κB迅速移位至细胞核内,与目的mMRA结合后,迅速上调IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8等促炎细胞因子的表达。Rho激酶能够加强炎性细胞的运动、黏附能力以及迁移出内皮细胞的能力,对炎症反应具有调控作用。而Rho激酶抑制剂可以抑制NF-κB的激活。由此可见,Rho激酶可能在脓毒症的炎症级联反应中发挥重要作用。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体,它是细胞内的一类多蛋白复合物,主要分布于胞间质及胞膜中,可参与多种宿主免疫和炎性反应,由感受蛋白-NLRP3、连接蛋白-凋亡相关点样蛋白(ASC)和效应蛋白-半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的前体组成。NLRP3炎症小体可识别一系列外源及内源性刺激,使caspase-1向活化形式转化,活化的caspase-1进一步促使细胞因子IL-1β和IL-18的前体切割成熟并活化,而IL-1β和IL-18是引起炎症启动的最强有力的细胞因子,能够逐级放大炎症反应的发生,加重组织损害。而Toll样受体(TLRs)是一类胞浆模式识别受体,能首先快速识别各种病原相关分子模式(PAMPs)以及各种危险相关分子模式(DAMPs),从而激活相应的炎症信号通路,引起机体非特异性免疫应答。但并不是所有的PAMP或DAMP均能够被细胞膜表面的模式识别受体所识别,NLRP3炎症小体在细胞质内能够识别这些进入细胞内的PAMPs或DAMPs,构成机体另一道防御屏障。TLRs和NLRP3炎症小体介导的信号通路合作,能够促进大量活化的细胞因子如IL-1β和IL-18的释放,进而促进炎症的发生和疾病的发展。所以在LPS介导的ALI中,可能是多种途径包括TLR4/NF-κB信号通路、NLRP3炎症小体等共同调控炎症反应的发生发展。目前认为急性肺损伤的发病机制与机体发生过度炎症反应有关,因此防止急性肺损伤的发生,降低病死率,我们应从如何调控炎症反应的发生与反应强度入手。急性肺损伤生物学标志物的探索,对疾病的早期诊断、治疗,降低死亡率等都具有非常重要的意义。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是一类长度约为21-25个碱基的小分子非编码RNA,通过与靶基因的mRNA特异性结合,在转录后水平调控靶基因的表达。研究表明,多种miRNAs在脓毒症急性肺损伤的炎症反应中发挥重要作用。有学者发现在LPS诱导的ALI小鼠血清及肺组织中miR-125b表达明显降低,上调ALI小鼠肺组织中miR-125b的表达能够明显抑制LPS诱导的ALI。敲低miR-7或者过表达miR-155均能减弱LPS导致的小鼠急性肺损伤炎症反应。而有的学者则发现在LPS诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中出现miR-214的高表达,提示miR-214可能在LPS诱导的ALI中起到了促炎因子的作用。miR-223最初被发现在肿瘤组织中表达失调,在某些实体瘤患者外周血中的表达也存在异常。miR-223在血小板内表达丰度很高,冠心病患者血小板miR-223表达水平能够反映其血小板活化程度和并与冠状动脉严重程度呈显著正相关。最近的动物研究发现,miRNA-223在机体感染时可能具有调节抗炎和细胞修复的作用,观察到miR-223缺失的小鼠会自发出现肺部炎症的病理变化,并在内毒素作用时发生大量组织的破坏。Neudecker等人也认为miRNA-223缺陷与严重的肺部炎症有关,提示miRNA-223可能参与了肺部炎症免疫功能的调节,但是具体的作用机制尚不明确。TLR4/NF-κB、NLRP3炎症小体两种信号通路可能共同参与ALI调控炎症反应的发生发展。miR-223对LPS诱导的急性肺损伤的发生、发展是否具有调控作用,作用机制是否与TLR4/NF-κB或NLRP3炎性小体信号通路有关,有待我们进行探讨。LPS是细菌内毒素的活性成分,细菌感染尤其是革兰氏阴性菌是引起急性肺损伤的主要致病因素之一。近几年,已建立了一系列动物模型来模拟不同发病机制引起的急性肺损伤,其中LPS诱导的急性肺损伤动物模型最为常用。[研究目的]本研究旨在通过检测在LPS诱导的小鼠和体外急性肺损伤细胞模型中miR-223的表达以及与炎性细胞因子表达的关系;并检测上调或下调miR-223对LPS诱导的细胞急性肺损伤模型中炎症反应的影响,探讨miR-223对LPS诱导的急性肺损伤炎症反应的作用及可能机制,寻找一种新的潜在的治疗ALI的靶点和判断ALI预后的生物学指标。[研究方法]1.急性肺损伤小鼠模型的建立选择C57BL/6品系小鼠16只,随机分为LPS组和对照组,每组8只,LPS组小鼠腹腔内注射LPS建立脓毒症急性肺损伤模型,首先观察两组小鼠的一般状况,24小时后提取两组小鼠肺组织标本,观察肺组织色泽、体积、有无充血渗出等。分析肺组织病理结构的变化,ELISA法检测小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表达,判断ALI小鼠模型是否构建成功。2.miR-223在LPS诱导的ALI炎症反应中的作用应用基因芯片技术分析ALI小鼠中miRNAs表达水平,筛选异常表达miRNA;用RT-qPCR方法分别检测LPS组与正常对照组小鼠肺组织中miR-223表达,以观察miR-223在LPS组小鼠中是否有异常表达;与LPS共培养构建A549细胞(腺癌人类肺泡基底上皮细胞)的ALI模型,用RT-qPCR方法分别检测LPS组与正常对照组A549细胞中miR-223表达,ELISA法检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平,并进行比较,以观察miR-223在ALI细胞模型中是否异常表达;通过转染miR-223的模拟物上调或anti-miR-223的模拟物下调A549细胞中miR-223的表达,检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平的变化,并进行比较,探讨miR-223对LPS诱导的ALI炎症反应是否有调控作用。3.miR-223调控ALI的靶基因及验证3.1在LPS处理的A549细胞中,通过RNA干扰技术敲低miR-223的表达水平,应用基因芯片技术分析miR-223调控的下游靶点,通过RT-qPCR、Western blot和免疫荧光实验分别检测靶基因mRNA和蛋白表达水平变化;过表达miR-223,通过RT-qPCR、Western blot实验分别检测靶基因mRNA和蛋白表达水平变化。用Targetscan数据库分析miR-223与NLPR3和小G蛋白RHOB靶蛋白结合位点,并结合双荧光素酶报告实验进行验证,分析miR-223调控NLPR3和RHOB表达的分子机制。3.2在LPS处理的A549细胞中,转染miR-223 mimics/inhibitor后,通过RT-qPCR法检测炎症因子mRNA的表达,通过ELISA法检测炎症因子蛋白的表达;为验证miR-223调控的各靶蛋白之间的上下游关系,在LPS诱导的细胞损伤模型中,依次分别将细胞分为阴性对照(Control)组、miR-223抑制剂(Anti-223)组和miR-223抑制剂联合其中一种靶蛋白过表达组,首先通过Western blot实验分析不同处理组中所有靶蛋白表达水平的变化,以探讨各靶蛋白之间的上下游关系。进一步通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,探讨各靶蛋白在miR-223调控ALI中的作用。[研究结果]1.急性肺损伤小鼠模型的建立及小鼠肺组织的病理改变。正常对照组小鼠进食饮水正常,活动自如;LPS组小鼠在LPS注射后6小时出现精神反应差、不思饮食、少动、体温上升及扎堆现象,随时间延长上述症状逐渐加重,并出现呼吸急促、腹泻等症状。小鼠肺组织石蜡切片HE染色显示,正常对照组小鼠肺组织肺泡结构完整,肺泡间隔厚度正常,肺泡腔内及肺间质均未见明显炎症细胞浸润及红细胞充填;LPS组小鼠肺组织可见部分结构破坏,肺泡结构紊乱,肺泡壁水肿,肺泡腔内有渗出液,肺泡及间质可见大量炎性细胞浸润;毛细血管内充满红细胞。ELISA法检测小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18的表达均明显升高,提示急性肺损伤小鼠模型建立成功。2.miR-223在LPS诱导的急性肺损伤中的作用应用基因芯片技术分析了 LPS组小鼠中miRNAs表达水平,发现LPS组小鼠肺组织miR-223表达较对照组明显下降(P<0.01),用RT-qPCR方法检测两组小鼠肺组织中miR-223表达,ALI组明显低于对照组(P<0.01)。与LPS共培养构建A549细胞的ALI模型,RT-qPCR方法检测A549细胞中miR-223表达与对照组相比显著下降(P<0.01),ELISA法检测A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显著升高(P<0.01)。与对照组作相比,过表达miR-223使A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显著下降(P<0.01),下调miR-223的表达,A549细胞中IL-1β和IL-18的表达显著上升(P<0.01)。3.miR-223调控ALI的靶基因及验证3.1 LPS诱导的细胞损伤中,miR-223抑制NLRP3、TLR4和NF-κB信号通路为了分析miR-223调控肺损伤中的作用机制,我们在LPS处理的A549细胞中,通过RNA干扰技术敲低miR-223的表达水平,应用基因芯片检测候选基因的表达水平,与对照组相比,抑制miR-223的表达水平后,能够显著上调TLR4、NF-κB、NLRP3的表达。为进一步验证该结果,进行RT-qPCR检测,与对照组相比,抑制miR-223的表达后能显著上调NLPR3、TLR4和NF-κB mRNA的表达水平(P<0.01)。我们通过Western blot实验检测抑制miR-223的表达水平后,能显著促进NLPR3、caspase-1、TLR4和NF-κB蛋白水平的表达(P<0.01)。而过表达miR-223后,能显著抑制上述蛋白的表达(P<0.01)。以上结果表明,在体外急性肺损伤模型中,miR-223能够调控NLRP3、caspase-1、TLR4和NF-κB的表达水平。3.2 miR-223抑制TLR4信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤为验证miR-223调控NLRP3、TLR4和NF-κB表达中三者的上下游关系,我们在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照(Control)组、miR-223抑制剂(Anti-223)组和miR-223抑制剂联合siTLR4(TLR4i)组,首先通过Western Blot实验分析不同处理组中TLR4、NLRP3、NF-KB和Caspase-1表达水平的变化,与Anti-223组相比,TLR4i组中TLR4和NF-κB表达水平均显著下调(P<0.01),表明siTLR4能够有效抑制TLR4的表达水平,并能够封阻miR-223抑制剂诱导的NF-KB的表达。而TLR4i组中NLRP3、Caspase-1的表达水平与对照组相比无明显差异(P>0.05),表明miR-223调控NLRP3和Caspase-1的表达是不依赖于TLR4的。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显著增加(P<0.01),而TLR4i组与Control组无明显差异(P>0.05),结果表明miR-223通过抑制TLR4的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。3.3 miR-223抑制NLRP3减轻LPS诱导的细胞损伤3.3.1 miR-223调控NLRP3表达的机制为了明确miR-223调控NLRP3表达的分子机制,我们应用TargetScan数据库分析了 miR-223与NLRP3 3’-UTR区域的结合位点,显示miR-223与NLRP33’-UTR区域具有潜在结合的能力。通过双荧光素酶报告实验对该结合位点进行验证,结果提示miR-223通过与NLRP33’-UTR区域结合,靶向调控NLRP3的表达。为进一步明确miR-223对A549细胞中NLRP3的调控作用,将阴性对照(Control)、miR-223抑制剂(Anti-223)分别转染A549细胞,48 h后通过免疫荧光检测对NLRP3表达的影响。与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中NLRP3的表达水平显著升高,说明下调miR-223水平能促进A549细胞中NLRP3的表达。3.3.2 LPS诱导的细胞损伤模型中miR-223抑制剂通过上调NLRP3诱导炎性因子的表达。为了验证NLRP3在miR-223调控的急性肺损伤模型中的作用,我们在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照(Control)组、miR-223抑制剂(Anti-223)组或 miR-223 抑制剂联合 siNLRP3(NLRP3i)组,首先通过 Western Blot实验分析不同处理组中NLRP3和Caspase-1表达水平的变化。与Anti-223组相比,NLRP3i组中NLRP3和Caspase-1表达水平均显著下调(P<0.01),表明siNLRP3能够有效抑制NLRP3的表达水平,并能够封阻miR-223抑制剂诱导的Caspase-1的表达。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平,与Control组相比,转染miR-223抑制剂的A549细胞中IL-1β和IL-18的表达水平显著增加(P<0.01),而NLRP3i组与Control组无明显差异(P>0.05),结果提示miR-223通过抑制NLRP3的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。3.4miR-223通过调控RHOB抑制NF-KB信号通路减轻LPS诱导的细胞损伤3.4.1 miR-223调控RHOB表达的机制为了验证miR-223在RHOB激活的炎症反应中的作用,我们应用TargetScan数据库分析了 miR-223与RHOB 3’-UTR区域的结合位点,显示miR-223与RHOB 3’-UTR区域具有潜在结合的能力。通过双荧光素酶报告实验对该结合位点进行验证,结果提示miR-223通过与RHOB 3’-UTR区域结合,靶向调控RHOB的表达。为进一步明确miR-223对A549细胞中RHOB的调控作用,我们通过Western blot实验分析了过表达miR-223对RHOB表达水平的影响,与Negative组相比,过表达miR-223后的A549细胞中RHOB的表达水平显著下调(P<0.01)。并通过Western Blot实验分析了 miR-223抑制剂对RHOB表达水平的影响,与Negative组相比,Anti-223组中RHOB的表达水平显著升高(P<0.01)。以上结果表明,miR-223通过靶向结合RHOB的3’-UTR区域抑制RHOB的表达。3.4.2 LPS诱导的细胞损伤模型中miR-223抑制剂通过上调RHOB调控NF-KB信号通路诱导炎性因子的表达为了验证RHOB在miR-223调控的急性肺损伤模型中的作用,在LPS诱导的细胞损伤模型中,将细胞分为阴性对照(Negative)组、miR-223模拟物(miR-223)组和 miR-223 模拟物联合 RHOB(RHOB)组,首先通过 Western blot实验分析不同处理组中RHOB、TLR4和NF-κB表达水平的变化,与miR-223组相比,RHOB组中RHOB和NF-κB表达水平均显著增加(P<0.01),而TLR4的表达水平无明显差异,表明A549细胞中,RHOB质粒得到有效表达,并能够恢复因过表达miR-223抑制的NF-κB的表达水平,但不影响TLR4的表达。通过ELISA实验检测上述不同处理组细胞中IL-1β和IL-18表达水平。与Negative组相比,miR-223组IL-1β和IL-18的表达水平显著下调(P<0.01),并且RHOB组与miR-223组存在显著性差异(P<0.01),以上结果表明miR-223通过抑制RHOB下调NF-κB的表达减轻LPS诱导的细胞损伤。[研究结论]1.本研究通过体内和体外两个层面发现:在LPS诱导的急性肺损伤中miR-223的表达水平显著降低,并与炎性细胞因子IL-1β、IL-18的表达水平呈负性相关;miR-223对LPS诱导的急性肺损伤具有保护作用。2.miR-223是一种ALI炎症反应的调控因子,在LPS诱导的急性肺损伤中可能通过负反馈调控RHOB激发的NF-κB信号、抑制TLR4及抑制NLRP3炎症小体发挥保护作用。miR-223有望成为一种新的治疗ALI的靶点。