植食性叶螨属于叶螨科（Tetranychidae），为多食性农作物和经济植物害螨，种类多，分布广。长期以来，叶螨依赖于化学防治，抗药性问题十分突出，研究探索叶螨类害螨微生物防治的新技术是一重大挑战。白僵菌、绿僵菌及拟青霉等常见丝孢类昆虫病原真菌是重要的生防真菌，已被开发用于农林害虫防治。这些生防真菌在叶螨种群中鲜见自然发生，但被认为有侵染螨类的潜力。国际上关于螨类微生物防治的综述性讨论较多，而付诸实践的研究报道很少，主要原因在于生防真菌杀螨毒力评价的技术难度大，高效杀螨菌株的筛选不易。国内则未见相关研究报道。本研究率先从建立生防真菌杀螨毒力的定量评价技术体系入手，以有代表性的朱砂叶螨（Tetranychus cinnabarinus）为靶标，筛选获得了对螨卵和成螨高毒力的菌种（株）；测定了高效杀螨菌株球孢白僵菌Bb2860的分生孢子与10种常用化学杀螨剂的生物学相容性，并评价了该菌株与生物相容性良好的哒螨灵低剂量互作的协同杀螨卵作用；研究了该菌株孢子悬乳剂的杀螨卵作用以及不同温湿度组合条件对其杀螨卵作用的影响。在此基础上，用高效杀螨菌株的孢子悬乳剂小试产品在浙江柑桔园和新疆棉田分别进行了柑桔全爪螨和棉叶螨的田间防治试验。主要内容和结果分述如下：生防真菌对螨卵的毒力测定研究建立了生防真菌对螨卵毒力的定量评价技术体系，比较测定了球孢白僵菌、玫烟色拟青霉和金龟子绿僵菌的10个菌株对螨卵的毒力。将产卵盛期的雌成螨20头一组移至琼脂平板中央的蚕豆叶片上，在25℃和12L:12D条件下任其繁殖12～18h，然后去除雌成螨，每叶片上留下的数十粒螨卵即为供试螨卵。各供试菌株均设高、中、低3个孢子剂量处理，梯度浓度的孢子液用含0.02％Tween 80的无菌水配制，每处理3～4次重复（载卵叶片），以含0.02％Tween 80的无菌水为空白对照。接种时先去除皿盖，将待处理载卵皿平置于高60 cm、直径48 cm的塑料桶底部，然后用手持式电动弥雾器在11000 r／min的转速下从桶上沿中央向下喷菌液15～20秒钟，让菌雾自由沉降5 min后取出培养皿。各悬浮液浓度下实际接种螨卵的孢子剂量，用放置在桶底叶片旁边的3只盖玻片（20×20 mm）收集沉降的孢子，然后在显微镜400×下每玻片5点取样镜检（0.2165 mm²／视野）孢子数，由此估计对应于供试菌株高、中、低3个浓度（孢子数／mm²）。从产卵到接种完成是一个不需人为移动螨卵的“无接触”（non-touch）过程，以防止螨卵人为损伤。接种后，载有螨卵的蚕豆叶片置于光照培养箱（25℃，12L:12D）中培养，逐日定时观察螨卵孵化率，直到对照组螨卵连续3天保持不变为止，一般需8～9天。结果表明，初感染的卵肉眼很难辩识，体视镜下可见卵表面出现轻微皱缩，但此时很难将此直接归因于真菌感染。将最终未孵化卵在25℃下保湿培养2～3天后，可见皱缩变瘪的卵粒长出菌物，并有供试菌株的特征，如菌落颜色、产孢结构及分生孢子特征。接种后第9天的螨卵死亡率因孢子剂量不同而差异显著。对各菌株的观察数据进行剂量-死亡率关系的机值分析，获得了各自的半致死剂量LC₅₀及其95％置信区间。球孢白僵菌Bb2860菌株对螨卵的毒力最强，LC₅₀为548个孢子／mm²。其次是玫烟色拟青霉Pfr116和Pfr153，LC₅₀值分别为848和913个孢子／mm²。两株金龟子绿僵菌的毒力较弱，LC₅₀值高达1717和1985个孢子／mm²，而其余供试菌株的毒力很差。结果表明，三种生防真菌均存在对螨卵有侵染力的菌株，但不同菌种或菌株的毒力差异很大。由此建立起来生防真菌杀螨卵的定量评价技术体系。生防真菌对成螨的毒力测定经过三年探索，研究建立了既保证生防真菌侵入又不影响成螨正常活动的毒力测定体系，并成功测定了2株球孢白僵菌（Bb2860和Bb734）、2株玫烟色拟青霉（Pfr116和Pfr153）和6株金龟子绿僵菌（Ma456、Ma576、Ma759、Ma5197、Ma727和Ma2080）对雌成螨的毒力。将带成对蚕豆叶片的叶柄插入生根剂（α-萘乙酸100μg／mL）水溶液中数分钟后，再扦插在小玻璃瓶（直径约2cm、高4cm）中的2％水琼脂上。玻璃瓶直立于直径9cm的培养皿中，并用水琼脂固定，使叶柄上的每对叶片相当于一个小植株，加盖塑料罩以维持系统内湿度相对稳定。将完成最后一次蜕皮不超过24h的雌成螨每10～15头转接至插入琼脂的成对叶片上，接受各菌株孢子水悬液的喷雾接种。各菌株的孢子剂量均按低、中、高三个剂量进行接种，梯度浓度的孢子液用含0.02％Tween 80的无菌水配制，空白对照均为该无菌水。采用标准喷塔法“无接触”接种，依次从对照、低浓度到高浓度顺序进行。各喷雾浓度下实际接种剂量的确定同螨卵生测，每剂量处理重复6～8次（载螨的成对叶片）。接种后的成螨在25℃和12L:12D条件下饲养，逐日观察9天，所获数据进行时间-剂量-死亡率模型的模拟分析。结果表明，2株白僵菌在29～1946个孢子／mm²剂量下杀螨31.9～87.7％，2株拟青霉在39～1554个孢子／mm²下杀螨19.4～77.7％，而6株绿僵菌在21～1626个孢子／mm²下杀螨24.2～80.3％。用模型模拟产生的剂量效应和时间效应参数计算出各菌株的半致死剂量LC₅₀及其95％置信区间和致死中时LT₅₀。结果显示，白僵菌Bb2860和Bb734接种后各时段的LC₅₀和各剂量下的LT₅₀均很小，表现杀螨快、毒力强的特点。拟青霉Pfr116和Pfr153的LC₅₀在接种后第5天即可测出，但在其后几天的下降趋势较平缓，第7天后的毒力大大低于2株白僵菌，其中Pfr116优于Pfr153。六株绿僵菌中以Ma456和Ma727的毒力最强，第9天的LC₅₀分别仅为179和197个孢子／mm²；Ma576、Ma759和Ma5197的毒力次之，第9天的LC₅₀为424～632个孢子／mm²；而Ma2080的毒力较差。各菌株对成螨的LT₅₀随接种剂量的增加而下降，且不同菌株之间差异较大。如在200个孢子／mm²的剂量下，仅Bb2860、Bb734、Ma456和Ma727菌株有LT₅₀可估算出来，范围为6.9～9.0天；在750个孢子mm²下，除Pfr153和Ma2080之外的各供试菌株的LT₅₀为5.2～8.5天；而在1500个孢子／mm²的剂量下，Ma2080仍无法估算出LT₅₀，而其余菌株的LT₅₀收敛为3.6～7.4天。通过各菌株对成螨LC₅₀和LT₅₀值的比较，Bb2860、Bb734、Ma456和Ma727等4株生防真菌显然属于高效杀螨菌株。温湿度对白僵菌孢子悬乳剂杀螨卵活性的影响温度和湿度是影响生防真菌孢子萌发和侵入的重要环境因子。首先，采用平板法测定了剂型化的白僵菌分生孢子（Bb2860孢子悬乳剂）在20、25和30℃与51％、74％和95％RH的9种温湿组合条件下的萌发率。结果发现，培养24 h时后，各温湿处理中的孢子萌发率均达到95％以上，但各处理前12 h的萌发率之间存在显著差异。随后，采用前述螨卵生测方法测定了该孢子悬乳剂在相同温湿组合条件下对螨卵的毒力，各组合处理中的低、中、高喷雾接种剂量分别为18、160和693个孢子／mm²。结果显示，各温湿组合处理的螨卵孵化率随接种后时间的延长而升高，但总是随孢子剂量的增大而下降，第9～10天后对照组再无孵化。各温湿组合条件下的孵化率观察值较好地拟合逻辑斯蒂模型（r²=0.88），其中温度、湿度、温湿互作以及温度与剂量的互作被识别为显著螨卵孵化速率的因子。根据各组合处理中孵化和未孵化卵数计算获得低、中、高剂量下的螨卵死亡率分别为15.0～40.4％、48.9～66.6％和62.9～87.5％，而对照组的自然死亡率仅5.6～11.3％。机值分析结果表明，孢子悬乳剂在9种温湿度组合条件下的LC₅₀为65～320个孢子／mm²，而在25、30℃与74％和95％RH的4个组合中的LC₅₀仅65～78个孢子／mm²。这说明悬乳剂不仅能够适应常态变化的田间环境，而且比未剂型化孢子的杀卵活性显著增强。白僵菌与常用化学杀螨剂的相容性及其协同杀螨卵效应筛选生物学相容的化学杀螨剂与生防真菌制剂混配混用，使药剂速效性与菌剂持效性相结合，是生产上减药增效策略的技术保障。通过测定10种常用化学杀螨剂在不同浓度下对白僵菌Bb2860分生孢子萌发率的影响，发现哒螨灵、克螨特和尼索朗的生物相容性甚佳，即使田间常规用药浓度也不显著影响孢子萌发率；常用浓度的5倍稀释液，乐斯本和哒螨灵的相容性达到相同水平，而有些参试药剂即使常用浓度的10倍稀释液也显著影响萌发率，如浏阳霉素、三唑锡、苦参碱等。在菌药互作杀螨卵的生物测定中，供试菌株的未剂型化分生孢子对螨卵的LC₅₀为546（406～818）个孢子／mm²，孢子水悬液中按田间常规用量的0.1％、2.0％和5.0％添加哒螨灵，LC₅₀分别降至322（220～527）、199（144～282）和75（48～103）个孢子／mm²，与未剂型化孢子相比，杀卵效价提高1.7～7.3倍。白僵菌孢子悬乳剂与低剂量哒螨灵混用对柑桔全爪螨的田间防效柑桔全爪螨（Panonychus citri）俗称柑桔红蜘蛛，是柑桔主要害虫之一，抗药性问题十分突出。在前期研究工作基础之上，将高效杀螨菌株球孢白僵菌Bb2860的孢子悬乳剂(含孢量为1×10¹⁰和2×10¹⁰个孢子／mL)于2005年秋在浙江黄岩3个坡地梯形柑桔园（试验1～3）进行了与低剂量哒螨灵菌药混用的田间药效试验，考查纯菌剂、纯药剂及菌药混用各处理对全爪螨的田间防效。试验1和2均包括7个处理，即4个用菌处理、1个纯用药对照（药液含哒螨灵AI 3.75μg／mL）、1个纯乳油对照和1个清水对照。4个菌剂处理分别为2个纯菌处理和2个菌药混用处理。每处理小区重复3次，每小区为约40米长的桔垅，约25～30棵桔树，各处理小区随机区组分布。各菌剂用水稀释100倍，采用背负式机动弥雾器以1.6马力5000转的额定功率、按150 L／ha的用液量进行机动弥雾，按15天间隔用菌2次。试验3在试验1和2的基础上增添了哒螨灵常规用量（11.25 g／ha，即药液含哒螨灵AI 75μg／mL）作为标准用药对照，同时菌剂喷雾浓度降至8×10⁶和8×10⁷个孢子／mL。试验中菌药混用处理中哒螨灵用量为562.5AI mg／ha，相当于标签推荐用量的3.75～6.25％。试验1～3的初始螨密度分别为17.8、15.0和12.0头／叶。与清水对照相比，试验1和2中1.5～3.0×10¹³个孢子／ha的用菌量与低剂量哒螨灵混用2次能将秋螨种群控制在很低水平达35天，相对防效和螨密度减退率总平均分别达到83.2～92.3％和73.8～91.2％。试验3中哒螨灵常规用药量对害螨作用快却不持久，药效仅维持5天左右；比试验1和2降低的用菌量也有显著防效，尤其菌药混用的控螨效果相当理想。三次田间试验的结果表明，在柑桔害螨防治中，采用≤1.5×10¹³个孢子／ha的用菌量与低剂量杀螨剂混用，足以及时有效地压低螨群密度，而且持效期长。菌药混用时，用菌量不必过高，有利于控制生防菌剂成本。这是国内外目前用球孢白僵菌防治柑桔全爪螨的首例成功田间试验。五种孢子悬乳剂对新疆棉叶螨的田间防效比较新疆是我国棉花主产区，品质好产量高，但常年遭受2～3种棉叶螨的严重危害。由于新疆棉区地理生态条件特殊，杀螨菌剂的设计不仅要考虑室内测定的毒力，还要考虑菌株的抗逆力。因此，选用球孢白僵菌Bb2860、Bb734和金龟子绿僵菌Ma456、Ma727及Ma2080等杀螨毒力高或生态适应性较强的5株生防真菌，用其孢子粉配制成含粉10％（w／v）的孢子悬乳剂，在新疆阿拉尔市的塔克拉玛干沙漠北缘中段棉区的两块棉田进行了棉叶螨的田间药效试验。试验1包括7个处理，即5个菌剂处理、1个清水对照和一个纯乳油对照。试验2剔除了试验1中表现差的Ma2080用菌处理，包括4个纯用菌处理、4个菌剂与低剂量乐斯本的混用处理，在试验1的两个对照之上增设纯用药对照（乐斯本用量为AI 7.2 g／ha，相当于田间常规用量的10％）。试验均采用随机区组设计，每处理3次小区重复，每小区48 m²。试验1间隔15天喷菌2次，试验2因受罕见高温影响仅喷菌1次，喷雾方法同上。结果显示，生防真菌孢子悬乳剂单用或与低剂量乐斯本混用，对棉叶螨具有显著的控制效果。其中，尤以绿僵菌Ma456与低剂量乐斯本混用的控螨效果最佳，低容量（150 L／ha）机动喷雾后第5日的螨密度减退率和相对防效达到92.4％和95.4％，第10日为93.9％和96.4％；白僵菌Bb734与低剂量乐斯本混用的控螨效果也相当理想，田间喷雾后第5日的螨密度减退率和相对防效为81.0％和89.1％，第10日为83.9％和91.1％。两次田间试验证实了生防菌剂对棉叶螨的显著防效，但试验2受高温影响较大，菌药混用的协同增效作用的显著性还有待进一步的试验证明。综上所述，本研究的主要成果和创新点在于：一是研究建立了生防真菌杀螨效果的评价技术体系，筛选获得了一批高效杀螨菌株。二是揭示了高效杀螨菌株的孢子悬乳剂能显著降低对环境湿度的依赖性，其杀螨效果显著优于未剂型化的孢子；筛选获得了与球孢白僵菌等生防真菌生物学相容的高效低毒化学杀螨剂，揭示了菌-药混用杀螨的互作效应。三是成功创制了以高效杀螨菌株分生孢子为有效成分的杀螨真菌制剂新产品，并分别在柑桔和棉花上进行了防治不同叶螨的田间试验，获得了很好的控螨效果。这些成果很好地填补了害螨微生物防治研究的理论和技术空白，尤其是菌-药互作效应的揭示和首例真菌杀螨剂的创制，对拓展生防真菌制剂应用、制定大面积减药增效的害螨防治新策略具有重要指导意义。