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草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂,是国内外防除一年生及多年生杂草的主要药剂。草甘膦的作用机制是抑制植物体内5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase,EPSPS)的活性,导致莽草酸大量积累,并抑制芳香族氨基酸的生物合成,进而扰乱正常的氮代谢致使植物死亡。田旋花(Convolvulus arvensis L.)属旋花科,是一种多年生恶性杂草,其繁殖和再生能力极强,是我国小麦、玉米、大豆、棉花等旱作物田的重要杂草,也是对草甘膦具有天然耐药性的杂草之一。本研究以田旋花为对象,以草甘膦的靶标EPSPS为主线,运用分子生物学等技术,研究田旋花对草甘膦的耐药性机制。主要结论如下:1.克隆的田旋花EPSPS基因片段长度为1707bp,将EPSPS基因推导出氨基酸序列与其它14种植物进行比对,结果显示田旋花EPSPS保守性较高,与其它植物相比田旋花在141位为丙氨酸,而其它植物为缬氨酸;此外,田旋花和打碗花在155位为丝氨酸,而其它植物为半胱氨酸。田旋花EPSPS氨基酸序列具有典型的EPSP-synthase结构。2.以田旋花cDNA为模板,合成EPSPS基因并连接到含有35S启动子和GUS基因的pBl l21载体上,构建植物超表达载体pBI-EPSPS。采用农杆菌介导法转化拟南芥,共获得15株转EPSPS基因拟南芥。对转EPSPS基因拟南芥进行草甘膦处理发现,转基因拟南芥草甘膦耐受性增强。3.采用实时荧光定量PCR测定了田旋花EPSPS基因在不同叶龄、不同器官的相对表达量以及草甘膦对田旋花EPSPS基因表达的影响。结果表明:田旋花EPSPS基因在不同叶龄表达有差异,在9叶期的表达量最高,是3叶期的2.1倍;EPSPS基因在叶的表达量高于茎、子叶和根;用草甘膦对田旋花进行茎叶喷雾处理,EPSPS基因的表达量先升高后降低,在处理后24小时达最大值。随着草甘膦浓度的提高,EPSPS基因表达呈增强趋势。4.根据已克隆的田旋花EPSPS基因cDNA序列设计三个嵌套引物,通过染色体步移技术获得了1142bp的EPSPS-P启动子片段(GenBank登录号: KC107822),对启动子序列分析显示该片段富含A/T碱基、TATA-box、CAAT-box及其它顺势作用元件如GATA-motif、TC-rich repeats、spl等。5.将EPSPS-P与GUS报告基因连接构建植物表达载体,利用农杆菌介导法获得转EPSPS-P拟南芥。对转基因拟南芥进行组织化学染色分析表明,EPSPS基因在根、茎、叶中都有表达,表达量的高低顺序是叶中最高,其次是茎和根。对转EPSPS-P拟南芥进行草甘膦处理,组织化学染色和GUS酶活性检测结果表明草甘膦处理可以引起EPSPS基因表达升高。