背景：胃癌(Gastric Carcinoma, GC)是位于第四位人类最常见肿瘤,也是肿瘤相关性死亡最常见的原因之一。在2008年,全球总共有989,600新增胃癌病例和738,000例胃癌估计死亡率,占全球癌症病例总数的8%和估计癌症死亡总人数的10%。而胃癌发病率最高的地区是在亚洲东部,东欧和南美。近年来,随着诊断技术的进步及针对肿瘤的外科手术和放化疗治疗策略的成熟,但由于胃癌的复发、转移,患者的预后仍然并不令人十分满意。此外,尽管TNM(tumor-node-metastasis)临床分期是使用最广泛的分期系统,并对胃癌患者的预后有提示意义,但它依旧是很难获得患者其它相对具体的临床预后信息。因此,发展对患者预后进行评估预测的新的生物标志物,对于目前来说是非常迫切需要的。而且胃癌相关基因及其蛋白分子不仅在了解胃癌的发病机制方面十分重要,在临床靶向性治疗和改善预后等方面也意义重大。Tspan5(tetraspanin 5, net4, TMS4SF9),属于四分子交联体超家族(tetraspanin)中的一员。Tetraspanin是四次跨膜的小分子细胞膜蛋白(20-50kDa),其特点是有四个比较保守的跨膜域(TM). TM延伸到细胞膜外,形成一个小的胞外环和一个大的胞外环,而在胞内则形成一个很短的氨基末端和一个羧基末端。Tetraspanin可以与其他同是Tetraspanin成员的细胞跨膜受体蛋白通过相互作用形成复合物,此复合物被称为富含tetraspanin的胞膜微结构域。在人类tetraspanin家族中已有33的成员被发现,但只有少数关于该家族成员在哺乳动物细胞上进行研究。有几项研究分别揭示在tetraspanin家族中,例如TSPAN1(NET-1)、 TSPAN13(NET-6)、TSPAN24(CD151)、TSPAN27(CD82)、TSPAN28和TSPAN29(CD9),表明他们在某些人类癌症中下调或表达升高,这意味着这些tetraspanin成员可能参与肿瘤发生或肿瘤的进展恶化。而相比之下,关于Tspan5在肿瘤的发生、发展和转移作用方面则所知甚少。我们都知道恶性肿瘤的特点是无限增殖,其无限增殖多与细胞周期和细胞凋亡障碍密切相关。细胞周期进程的失调被认为在肿瘤发生中发挥着重要作用。大量的研究表明,细胞周期失调在肿瘤复发及进展方面负有很大的责任。在本文中,我们旨在研究Tspan5在胃癌发生发展中所起的作用及其临床意义。此外,我们对Tspan5和胃癌细胞周期蛋白变化之间的关系非常感兴趣,希望可以揭示肿瘤发生发展的机制,发展新的治疗方法和预测疾病预后的生物标志物。目的：1明确Tspan5在临床胃癌组织标本中的表达情况,与胃癌患者病情发展、预后的关系。2探讨Tspan5在影响胃癌细胞增殖、生长方面的生物学作用。3在体内外探讨Tspan5对胃癌细胞周期的影响及其相关机制。4探讨Tspan5在影响胃癌细胞侵袭转移方面的生物学作用。方法：1采用组织免疫化学染色的方法在114例临床胃癌组织标本中,分析Tspan5的表达量与临床胃癌发展、预后的关系。2基于基因克隆技术,将Tspan5片段克隆到逆转录病毒表达质粒plncx2-GFP-IRES中,经酶切、测序鉴定正确无误后,与pVSV-G共转染至GP2-293细胞中进行病毒包装。将包装的高表达逆转录病毒感染胃癌AGS和MKN45细胞,而后经G418初步筛选形成稳定株,然后经Western blot鉴定后,扩大培养、冻存稳定细胞株。3 CCK-8法检测稳定高表达Tspan5的重组细胞的增殖生长情况,同时用平板克隆形成实验检测重组细胞在体外克隆形成的能力,然后将重组胃癌细胞在裸鼠皮下接种成瘤,观察其在裸鼠体内的成瘤能力。4通过流式细胞术分析Tspan5对胃癌AGS和MKN45细胞周期的影响。同时,通过蛋白电泳及瘤体组织片免疫组化对重组胃癌细胞周期蛋白分子Cyclin D1、CDK4、p15、p27、E2F1和pRB的变化进行验证。5细胞趋化运动和侵袭转移实验,划痕实验分析Tspan5在重组胃癌AGS和MKN45细胞在体外的转移能力所起的作用。结果：1在114例临床标本中,通过免疫组化染色显示,Tspan5低表达于胃癌组织而高表达于相应癌旁组织。在癌组织中,Tspan5的表达量的高低与肿瘤大小、肿瘤侵袭程度、肿瘤淋巴结转移和临床TNM分期密切相关。随着TNM分期程度的升高,Tspan5表达量逐渐降低。在生存期分析中,低表达Tspan5癌组织的患者,与高表达Tspan5癌组织的患者相比,其中位生存时间和生存率均显著下降。2逆转录病毒表达载体plncx2-GFP-IRES/Tspan5经酶切和测序鉴定构建成功,并与pVSV-G在GP2-293细胞中包装得到了高表达Tspan5的逆转录病毒。该病毒感染的胃癌AGS和MKN45细胞经高浓度G418筛选得到了稳定的重组细胞株。重组细胞株经Western blot实验证实构建成功。3 CCK-8实验中高表达Tspan5的胃癌AGS和MKN45重组细胞株,体外生长速度明显慢于对照细胞(AGS-RV和MKN45-RV);平板克隆实验显示高表达Tspan5的胃癌AGS和MKN45重组细胞株的体外克隆生长能力明显弱于对照细胞,克隆形成的大小也小于对照组细胞,差异具有统计意义。裸鼠皮下成瘤实验也显示了高表达Tspan5的胃癌AGS和MKN45重组细胞株的皮下成瘤速度及大小均明显弱于对照组细胞(AGS-RV和MKN45-RV),差异具有统计意义。4我们也进一步证明Tspan5在从细胞周期G1期到S期的过渡阶段进行调控,是通过增加p15／p27蛋白的表达,同时减少细胞周期蛋白Cyclin D1/CDK4/ E2F1/p-RB的表达而实现的。5我们在高表达Tspan5的重组胃癌细胞株中,通过转染pCMV-Myc-CDK4,重新高表达其CDK4蛋白量,并通过蛋白电泳证实上调成功。48小时后,我们使用CCK-8分析评估该重新高表达CDK4的细胞的增殖能力情况。我们发现在胃癌AGS或MNK45细胞中,转染了质粒pCMV-Myc-CDK4的高表达Tspan5的细胞与转染空载质粒pCMV-Myc的高表达Tspan5的细胞相比,其增殖能力显著升高,并较对照组(control组)的增殖能力升高。同样,转染表达质粒pENTER-Cyclin D1后,其增殖能力也显著增加,并较对照组(control组)增殖能力也升高。这表明Tspan5抑制胃癌细胞的增殖是通过控制细胞周期从G1期到S期的过渡阶段,通过下调Cyclin D1和CDK4蛋白表达量而实现的。6细胞趋化运动和侵袭转移运动(transwell)实验表明,Tspan5显著抑制了胃癌AGS和MKN45细胞的侵袭转移能力。与transwell的实验结果一致,划痕实验也得到了类似的结果。因此,以上结果表明,Tspan5可能可作为抑制胃癌细胞的侵袭转移的抑癌基因。结论：在临床胃癌组织中,Tspan5氏表达于癌组织而高表达于相应癌旁组织,Tspan5的表达量的高低与肿瘤大小、肿瘤侵袭程度、肿瘤淋巴结转移和临床TNM分期密切相关。随着TNM分期程度的升高,Tspan5表达量逐渐降低。在生存期分析中,低表达Tspan5癌组织的患者,与高表达Tspan5癌组织的患者相比,其中位生存时间和生存率均显著下降。以上提示Tspan5可能是一个新的胃癌抑制分子。通过基因克隆技术、逆转录病毒包装技术和蛋白电泳验证,我们成功构建了稳定高表达Tspan5的胃癌AGS和MKN45重组细胞株。通过CCK-8实验和平板克隆形成实验证实高表达Tspan5抑制胃癌AGS和MKN45重组细胞的体外增殖和生长。裸鼠皮下成瘤实验显示高表达Tspan5抑制胃癌AGS细胞的成瘤能力。高表达Tspan5可以抑制胃癌AGS和MKN45重组细胞由G1期到S期的进程,其分子机制是下调Cyclin D1、CDK4、pRB和E2F1蛋白分子的表达和上调抑癌因子p27和p15的表达。同时在裸鼠的移植瘤的免疫组化中,Cyclin D1, CDK4, E2F1, pRb, p27和p15这四种分子的变化与在上诉的变化一致。我们又通过在高表达Tspan5的重组胃癌细胞基础上上调Cyclin D1或CDK4的表达量后,其周期进程抑制现象得到缓解。上诉实验结果均表明Tspan5在胃癌中的作用是抑癌基因,可作为发展新的治疗胃癌方法和预测胃癌患者预后的生物标志物。