龋病是人类最常见的感染性疾病之一,变异链球菌（简称变链菌）是公认的主要致龋菌。针对其的早期研究,由于认识和研究方法的局限性,大多集中于浮游状态的标准菌株。近来随着认识的深入,研究者们意识到口腔牙菌斑是典型的生物膜结构,生物膜中变链菌的生长方式及基因表达情况,与浮游状态的细菌相比有较大差异。生物膜作为变链菌生长的微环境,在龋病形成和发展中起重要作用。由此可见,生物膜对变链菌的生存乃至进一步发挥其致龋毒力,都有着至关重要的意义。再者,现有的研究已证实变链菌不同菌株的致病性存在差异,因此,相较于标准菌株而言,研究来自于不同龋敏感者变链菌临床株的致龋性差异及其内在原因成为当前研究的热点。同时,随着新技术,如二维电泳和质谱技术的出现,细菌蛋白质组学的分析成为可能,针对变链菌的蛋白质组学尤其是功能蛋白质组学研究,对于进一步明确龋病的发病机制有着重要意义。本课题组前期已从不同龋敏感人群分离得到变链菌临床株593号菌株（血清C型菌株,来源于高龋患者）和18号菌株（血清C型菌株,来源于无龋健康人）。两菌株不仅在体内表现出致龋差异,通过基因型分析和一系列体外致龋实验发现,其基因型和体外致龋能力也存在差异。在此基础上,本研究利用一、二维电泳、生物质谱等技术,通过分析两菌株在浮游和生物膜状态功能蛋白表达,尤其是表面相关蛋白表达差异,从而探讨两菌株间致龋性存在差异的原因。选择表面相关蛋白表达作为本研究的重点,是由于变链菌的大部分致龋毒力因子均分布于表面,其中涉及了决定其致龋力的各个方面,即细菌粘附、生物膜形成、菌细胞代谢碳水化合物能力及细菌对不断波动环境的适应能力四个方面。本研究包括两部分实验:第一部分变异链球菌临床株体外生物膜形成情况及蛋白表达初步分析目的:了解变链菌临床株体外生物膜的形成规律,及生物膜成熟初期的蛋白表达情况。方法:（1）采用微孔板培养,染色、分光光度测定法(A₆₃₀)绘制体外不同pH条件下（pH7.0～5.0）593号、18号菌株以及变链菌标准株（ATCC25175）的生物膜生长曲线。（2）采用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）一维电泳技术,分析标准株在不同时间点（16h、18h、20h、22h、24h）生物膜中菌体可溶性蛋白表达情况。结果:（1）体外变链菌各株在pH5.0时均不能形成生物膜;pH7.0条件下的细菌生物膜形成表现为缓慢的非线性生长,12～24h生物膜开始成熟,24～36h间出现一相对的生长停滞期;pH5.0对已形成12h的变链菌生物膜生长有明显的抑制作用,但经历12h的酸休克后各菌株的生物膜均能恢复生长。（2）16～24h不同时间点标准株生物膜菌体可溶性蛋白的SDS-PAGE电泳图谱一致,未见特异表达和高表达的蛋白条带。结论:（1）变链菌在体外pH7.0时于12～24h形成稳定的生物膜,该生物膜能抵抗一定程度的酸（pH5.0）攻击,而浮游状态的细菌则不能。（2）16～24h不同时间点变链菌生物膜菌体可溶性蛋白表达无差异。第二部分浮游和生物膜状态变异链球菌临床株表面相关蛋白表达差异分析目的:（1）分析变链菌临床株在两种不同生存状态（浮游和生物膜状态）表面相关蛋白表达的差异。（2）分析生物膜状态不同变链菌临床株（593和18号菌株）表面相关蛋白表达的差异。方法:采用Homer法提取593号和18号菌株在浮游和生物膜状态下的表面相关蛋白,经SDS-PAGE、二维电泳确定差异点,对差异点进行基质辅助激光解离飞行时间质谱分析得PMF,通过NCBInr数据库检索、分析、鉴定蛋白质。结果:（1）相较于浮游状态,生物膜状态的593号和18号菌株SDS-PAGE电泳图谱在57.5KDa和67.9KDa存在共同特异条带,且在42.5KDa、38.5KDa和27.2KDa处存在共同高表达条带,经二维电泳进一步分析,发现57.5KDa的特异蛋白条带实际包含2个高表达蛋白位点;而42.5KDa和38.5KDa的高表达条带分别包含1个高表达蛋白位点和1个特异表达蛋白位点;（2）生物膜状态593号和18号菌株的SDS-PAGE电泳图谱基本一致,但经二维电泳分析却发现两菌株均有各自特异和高表达的蛋白位点。经对这些差异蛋白位点的消化、鉴定,发现其主要涉及细菌能量代谢、RNA合成、蛋白翻译和折叠等生物学功能。结论:本研究条件下,比较浮游和生物膜状态下两菌株的表面相关蛋白表达,发现二者在生物膜状态均出现某些蛋白的特异和高表达,这可能是其成膜时的共性变化;此外,生物膜状态593号菌株和18号菌株的表面相关蛋白二维图谱明显不同,经鉴定发现593号菌株中高表达和特异表达的蛋白涉及致龋力的各个方面,推测这可能是593号菌株表现出高致龋性的部分原因。