Osteopontin在脊髓运动神经元凋亡过程中表达的变化及其意义 目的 用“坐骨神经撕脱法”建立“脊髓运动神经元凋亡”的动物模型,检测损伤前后Osteopontin（OPN） mRNA在脊髓运动神经元中的表达变化,探讨OPN mRNA在脊髓运动神经元凋亡中的作用。 材料与方法 1.大鼠脊髓运动神经元凋亡模型的建立 所有实验用鼠均为八周龄雄性Wistar鼠（均重200g,共30只）。用改良的Martin法制作坐骨神经椎管外撕脱导致脊髓运动神经元凋亡的模型。先利用1.4%氟烷及1.5L/min氧气对动物行吸入麻醉,于左侧骨盆的外侧和后肢的上部作正中切口,钝性分离股二头肌和臀肌,显露坐骨神经,然后逆寻至骨盆深部,椎管外。用小血管钳将坐骨神经从椎间孔拉出,使其与脊髓分离。放松肌肉,关闭切口。 2.组织标本采集 分别于术后1、3、7、14或21天处死动物。在戊巴比妥麻醉下,通过灌注泵用冷生理盐水及4%的低温多聚甲醛（溶于pH=7.4的PBS中）对实验鼠进行心内灌注。收集含有L₃、L₄脊髓的组织块,于固定液中4℃过夜固定,然后低温保护于含20%蔗糖的PBS溶液中过夜。用恒温切片机切取12-μm的切片并放置于多聚赖氨酸包埋的载玻片上。 3.Nissl染色 利用甲酚紫对切片进行染色。 4.原位杂交 5.原位杂交与荧光免疫组化双染色 原位杂交反应后,PBS清洗切片5min,然后与一抗在4℃下反应过夜。