猪细小病毒PK-15细胞适应株的培育及其灭活疫苗的制备

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猪细小病毒是引起母猪繁殖障碍疾病的重要病原之一,接种猪细小病毒灭活疫苗是预防和控制该疾病的最有效的措施。本研究旨在研究猪细小病毒增殖规律,获得猪细小病毒细胞适应株,并用该病毒适应株按照《中国兽药典》(2010版)和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求建立地方毒种,筛选优良灭活疫苗。本实验利用PK-15细胞从流产胎儿的肝脏、肠系膜淋巴结和肾脏中分离到一株猪细小病毒(Porcine Parvovirus, PPV),盲传至出现稳定细胞病变(CPE),获得PK-15细胞适应株PPV-SC-L。针对PPV的NS1基因设计特异性引物,建立实时荧光定量PCR方法,对PPV进行绝对定量。利用该方法检测PPV分离株同步接毒和分步接毒的病毒含量,绘制一步生长曲线;同时检测PPV在Hela、MDBK.PK-15、 ST、F81、BHK-21和Marc-145细胞上的病毒含量。根据《中国兽药典》(2010版)和《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》(2001年版)要求建立PPV-SC-L地方毒种,然后使用甲醛灭活,分别选择白油、铝胶和蜂胶为佐剂制备灭活疫苗,进行免疫效力试验,筛选出效果良好的灭活苗。试验结果显示,PPV分离株盲传至12代产生CPE,接种细胞40h开始出现CPE,56h CPE达80%左右,成功培育出PPV的PK-15细胞适应株。经过各种条件优化,成功建立荧光定量PCR方法;一步生长曲线显示,分步接毒的病毒含量高于同步接毒,而增殖周期短于同步接毒;PPV在不同细胞的增殖结果显示,各细胞开始出现CPE时间依次为PK-15、ST、Hela和MDBK,病毒含量高低依次是ST.PK-15、 MDBK和Hela,而PPV不能在F81、BHK-21和Marc-145细胞增殖;PPV-SC-L株毒种检验结果,毒种无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染,病毒含量达到疫苗使用标准;PPV-SC-L株灭活苗检验结果显示,疫苗具有纯净性,对豚鼠和仔猪具有良好的安全性;免疫效力试验显示以白油为佐剂灭活苗具有良好免疫效力,HI最高达1:1024,其次是铝胶佐剂灭活苗,两组疫苗实验组攻毒后均无临床反应,保护率为100%;蜂胶佐剂灭活苗产生的抗体水平低,疫苗保护率仅为40%,对仔猪无法起到全面保护作用。结果表明,PPV在同一细胞以同步和分步接种其增殖规律有较大差异;PPV能在多种细胞增殖,但病变时间和病毒含量不同细胞之间均有差别,出现病变时间先后与病毒含量多少无明显相关性。PPV-SC-L毒株以甲醛灭活,白油为佐剂制备的灭活苗能抵抗PPV强毒感染,可作为猪细小病毒预防和控制候选疫苗。
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