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铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是传统的名贵中药材,其主要生物活性成分为多糖,铁皮石斛多糖对结肠健康具有促进作用。绝大多数的多糖作为膳食纤维在经过人体消化道时,不会受到各种消化酶和转运蛋白的影响,而是作为底物被人体共生的肠道菌群降解利用,其代谢产物同时影响人体的肠道健康。本文初步探究了铁皮石斛多糖在体外环境下对人肠道菌群结构和菌群代谢产物的影响,使用的铁皮石斛系雁荡山铁皮石斛,肠道菌群来自厦门大学附属中山医院制备的健康供体粪菌。研究内容主要包括铁皮石斛多糖的提取纯化及其单糖组分鉴定、铁皮石斛多糖对肠道菌群结构和代谢产物变化的影响及相关性分析。一、将铁皮石斛多糖的含量作为评价指标,使用苯酚硫酸法检测多糖的含量,以料液比、提取温度和提取时间作为影响因素进行正交试验,优化铁皮石斛多糖的提取工艺。实验结果表明:三种因素对铁皮石斛多糖提取率的影响由大到小排序依次为:温度>料液比>提取时间,铁皮石斛多糖的最佳提取条件为提取温度80℃、料液比1:40、提取时间2小时,并通过验证试验证明了该提取条件的稳定性,在此提取条件下的铁皮石斛多糖的提取率为31.85%。使用考马斯亮蓝法检测蛋白质含量,结果表明精制石斛多糖中不含蛋白质,使用PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化检测铁皮石斛多糖的单糖组成以及含量,结果表明铁皮石斛多糖中的单糖主要由甘露糖(49.03%)、葡萄糖(16.54%)和半乳糖(14.83%)组成。二、体外发酵法研究铁皮石斛多糖对肠道菌群的影响。实验组添加200 mg的铁皮石斛多糖,对照组添加等剂量的超纯水,分别在接种后第0、4、8、12、24、36、48小时取样分析。结果如下:(1)发酵24小时内,实验组发酵液中的总糖含量由739.45±11.74mg/L快速降低到270.86±20.47mg/L,24小时之后,多糖的消耗速率变慢,说明铁皮石斛多糖被肠道菌群吸收利用,从而使得肠道菌群在发酵过程中快速生长;(2)接种后4个小时,在发酵液中一共发现了三种单糖,三种单糖均为铁皮石斛多糖的主要组分,分别是甘露糖、葡萄糖和半乳糖。随着发酵的进行,这三种单糖的含量均一定程度的下降,并且在接种后12小时的发酵液中检测不到葡萄糖,接种后36小时的发酵液中检测不到甘露糖和葡萄糖。这个结果表明铁皮石斛多糖能够被肠道菌群降解成单糖,降解形成的单糖能够继续被肠道菌群利用;(3)发酵48小时后,铁皮石斛多糖实验组发酵液中的总短链脂肪酸的浓度为51.76±0.45mM,明显(P<0.05)比空白对照组(接种48小时后浓度为35.74± 0.26 mM)要高。两组实验发酵过程中短链脂肪酸产生的差异与pH变化的差异是一致的,发酵进行48小时后,铁皮石斛实验组发酵液的pH显著(P<0.05)降低,接种时发酵液pH值为6.95,接种后48小时的发酵液pH值为4.70,而空白对照组的pH值则没有明显的变化,接种时发酵液pH值为6.98,接种后48小时的发酵液pH值为6.71。接种后48小时,铁皮石斛多糖实验组中的乙酸、丙酸和丁酸(发酵48小时的发酵液中各酸浓度分别为30.75 ± 0.37 mM、12.43 ±0.05 mM和8.58±0.10 mM),浓度相比较空白对照组均有显著(P<0.05)的提升(发酵48小时的发酵液中各酸浓度分别为18.67 ± 0.15 mM、9.06 ± 0.11 mM和 7.01 ±0.07 mM)。(4)使用IlluminaHiSeq2500系统对发酵过程中肠道菌群16srDNA测序分析,研究肠道菌群结构的变化,结果表明:发酵48小时的过程中,添加铁皮石斛多糖的实验组和对照组的肠道菌群结构有着较大的差异;实验组拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)显著增加,而变形菌门(Proteobacteria)显著减少;在属分类水平上,实验组中的普氏菌属(Prevotella)、厌氧杆菌属(Bacterioides)、毛螺菌科(Lachnoospiracea)和栖粪杆菌属(Faecalibacterium)有益菌显著增加,而条件致病菌柠檬酸细菌属(Citrobacter)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)显著减少;实验组相比较而言保留更多的操作分类单元(Operational Taxonomic Units,OTU)数目,可见铁皮石斛多糖能够更好的维持体外培养肠道菌群与体内肠道菌群的相似性;铁皮石斛多糖能够提高益生菌的生长并抑制致病菌的生长。三、使用气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)研究铁皮石斛多糖对肠道菌群代谢产物的影响,对小分子代谢产物进行定性和相对定量分析,使用PCA(主成分分析)和PLS(偏最小二乘法)方法分析铁皮石斛多糖对于肠道菌群代谢产物的影响,结果表明:铁皮石斛多糖实验组的短链脂肪酸和支链氨基酸的代谢水平均相对较高,对于发酵过程pH值有着重要的影响。