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本文以来源于鳞翅目凤蝶科(Papilionidae)的柑橘凤蝶Papilio xuthus新孵幼虫细胞系RIRI-PX1作为试验材料,采用半固体显微操作法对其进行单细胞克隆,并测定克隆株外源基因表达特性,筛选出了蛋白表达水平显著高于亲本细胞系RIRI-PX1的单细胞克隆株RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31,并对其进行生物学特性研究;同时对克隆株RIRI-P X1-C24和RIRI-PX1-C31进行了无血清驯化,比较驯化前后群体倍增时间和重组蛋白表达水平。主要研究结果如下:1、RIRI-PX1单细胞克隆株建立使用半固体显微操作法对RIRI-PX1进行单细胞克隆,最适接种密度2.5×10~5个/m L。获得14株稳定传代的克隆株:RIRI-PX1-C2、RIRI-PX1-C7、RIRI-PX1-C10、RIRI-PX1-C14、RIRI-PX1-C15、RIRI-PX1-C18、RIRI-PX1-C19、RIRI-PX1-C23、RIRI-PX1-C24、RIRI-PX1-C26、RIRI-PX1-C29、RIRI-PX1-C30、RIRI-PX1-C31和RIRI-PX1-C32。2、柑橘凤蝶高效表达克隆株的筛选采用重组绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)杆状病毒Ac MNPV-GFP、重组β-半乳糖苷酶(β-galactosidase enzyme,β-Gal)杆状病毒Ac MNPV-Gal,以及重组分泌型碱性磷酸酶(secreted alkaline phosphatase,SEAP)杆状病毒Ac MNPV-SEAP作为测试病毒感染14个柑橘凤蝶单细胞克隆株,测定重组蛋白的表达水平。最终筛选出对重组GFP表达水平显著高于亲本细胞系的克隆株RIRI-PX1-C24(P<0.05),以及对重组β-Gal表达水平显著高于亲本细胞系的克隆株RIRI-PX1-C31(P<0.05)。3、RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31的生物学特性细胞形态学方面,RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31与亲本细胞系RIRI-PX1,在细胞组成上均为圆形和梭形细胞,克隆株细胞中圆形细胞所占比例增加且直径大于亲本细胞系。细胞增殖动力学分析结果显示,RIRI-PX1及其克隆株RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31的群体倍增时间分别为47.86 h、40.79 h和62.51 h,其中克隆株RIRI-PX1-C24的倍增时间与亲本细胞系相比有所缩短。核型分析结果显示,RIRI-PX1及其克隆株RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31的染色体数量均呈正态分布,RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31的平均染色体数目分别为107.65±33.71和104.53±31.57,与亲本细胞系RIRI-PX1的平均染色体数目(119.75±32.79)存在显著差异(P<0.05)。通过比对克隆株与亲本细胞系的细胞色素c氧化酶亚基I基因(COI)序列,证明RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31来源于R IRI-PX1。用10条ISSR引物进行3个细胞系的指纹图谱分析中,7条引物扩增条带在这3个细胞系间存在差异,说明克隆株及其亲本细胞系在基因型上存在差异。细胞对野生型苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(wild-type Autographa californica multiple nucleopolyhed rosis virus,wt-Ac MNPV)的敏感性研究显示,亲本细胞系和克隆株细胞均能够被wt-Ac MNPV侵染,且2个克隆株对wt-Ac MNPV的敏感性均显著高于亲本细胞系(P<0.05)。4、RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31的无血清培养以5种商品化昆虫细胞专用无血清培养基Express Five SFM、EX-CELL 405、Sf-900 III SFM、Sf-900 II SFM,以及Hy Clone Serum-Free Media为试验用培养基,采用渐进替换原培养基的方法,分别对表达量较高的克隆株RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31进行无血清驯化。同时,逐渐降低原培养基(Grace)中的血清含量,确定供试细胞系所能耐受的最低血清含量。克隆株RIRI-PX1-C24无法在5种无血清培养基中生长并稳定增殖。其所能耐受的最低血清含量为5%,细胞群体倍增时间由56.55 h延长至88 h,对3种重组蛋白的表达水平无显著提高(P>0.05)。RIRI-PX1-C31在无血清培养基Express Five SFM中能够稳定传代,在其余4种无血清培养基中,细胞随着血清含量的降低,逐渐停止增殖。驯化后的RIRI-PX1-C31细胞增殖速率较驯化前有显著降低,但对重组β-Gal和SEAP的表达水平却显著高于驯化前水平(P<0.05)。RIRI-PX1-C31在Grace培养基中所能耐受的最低血清含量为5%,细胞群体倍增时间延长至69 h,对3种重组蛋白的表达水平无显著提高(P>0.05)。综上所述,利用高效表达细胞株筛选技术对柑橘凤蝶细胞系RIRI-PX1单细胞克隆株进行筛选,获得了14个克隆株,其中克隆株RIRI-PX1-C24和RIRI-PX1-C31分别对重组GFP和β-Gal的表达量显著高于亲本细胞系RIRI-PX1(P<0.05)。此外,RIRI-PX1-C31可在无血清培养基Express Five SFM中稳定传代增殖,且对重组β-Gal和SEAP的表达水平较驯化前有显著提高,值得进一步研究。