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【目的】 1. 制备包裹阿霉素(Doxorubicin,DOX)和血红蛋白(Hemoglobin,Hb)的聚乙交酯丙交酯共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)核心,表面覆盖 MCF-7 癌细胞膜构建仿生靶向纳米氧载体(DHCNPs),对其进行理化表征。 2. 对DHCNPs进行体外细胞学实验,探讨DHCNPs对肿瘤细胞的同源靶向性能及其改善缺氧肿瘤化疗耐药的机制。 3. 对 DHCNPs 进行肿瘤模型体内实验,考察 DHCNPs 改善肿瘤缺氧的效果,并评价其在体内的生物分布、抗肿瘤效果和生物安全性。 【方法】 1. 超声法合成包载 DOX 和 Hb 的 PLGA 纳米核心,并采用薄膜挤压将MCF-7 癌细胞膜覆盖在 PLGA 纳米核心表面制得仿生靶向纳米氧载体(DHCNPs)。采用透射电镜(Transmission electron microscopy,TEM),动态光散射(Dynamic light scattering,DLS),紫外/荧光仪分析对DHCNPs的形貌、粒径和光学性质进行表征;用聚丙烯酰氨凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis , SDS-PAGE ) ,蛋白免疫印记( Western blot )分析 DHCNPs 表面的癌细胞膜蛋白粘附因子;采用氧气荧光探针(Ru(dpp)3Cl2 )考察DHCNPs的释氧行为。 2. 流式细胞术考察DHCNPs对不同细胞的靶向选择性;实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR,qRT-PCR)和Western blot分析 DHCNPs对缺氧肿瘤细胞中缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α),多药耐药基因(Multi drug resistance gene-1,MDR1)和P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达的影响;共聚焦显微镜考察缺氧肿瘤细胞对 DHCNPs 的摄取情况;采用细胞存活率实验评价DHCNPs的细胞毒性。 3. 以荷MCF-7乳腺瘤裸鼠为研究对象,小动物成像系统对通过荧光成像考察 DHCNPs 的体内生物分布;小动物光声成像实时监测实体瘤内部氧含量的变化情况;免疫组织化学(荧光)和 Western blot进一步验证 DHCNPs在肿瘤内改善缺氧的效果;通过肿瘤体积和肿瘤组织形态学评价 DHCNPs 抑制肿瘤的效果;采用器官组织形态学和血液生化指标评估DHCNPs的体内生物安全性。 【结果】 1. 纳米颗粒的合成和表征:目标产物 DHCNPs具有典型的核壳结构,粒径均一,大小约为 30-50 nm。紫外/荧光光谱显示 DHCNPs具有 DOX和Hb的光学特性。SDS-PAGE和 Western blot分析证明 DHCNPs表面保留了癌细胞膜蛋白粘附因子。DHCNPs比游离的Hb具有更优的携氧能力,在120 min内释放的氧气含量大约是游离Hb的2.8倍。 2. 体外生物学分析:DHCNPs 对于同源 MCF-7 细胞具有特异靶向功能。DHCNPs能有效抑制缺氧 MCF-7细胞中 HIF-1α,MDR1和 P-gp的表达水平。通过肿瘤同源靶向作用和供氧调控,DHCNPs能提高DOX在细胞内的含量。体外细胞毒性实验证明 DHCNPs 在靶向至肿瘤细胞后能改善缺氧诱导的化疗耐药,进而提高化学治疗效果。 3. 体内实验结果评价:尾静脉注射后,DHCNPs靶向富集在MCF-7实体瘤部位,并在 12 h内有效提高肿瘤区域的氧气含量,缓解实体瘤的缺氧微环境,并降低P-gp表达,最终提高肿瘤组织中DOX的含量。DHCNP能够有效地抑制肿瘤的生长,降低DOX对心脏的毒性作用。 【结论】 1. 成功构建了核心包载 DOX和 Hb,表面覆盖癌细胞膜的仿生靶向纳米氧载体(DHCNPs)。DHCNPs保留了癌细胞膜上的粘附因子,同时具有类似Hb 的携氧能力。 2. DHCNPs 对同源肿瘤细胞具有特异的靶向能力,可以将药物靶向传递至肿瘤部位。同时 DHCNPs 能改善肿瘤细胞的缺氧状态,证明携带的 Hb 成功赋予DHCNPs供氧调控的能力。 3. DHCNPs在同源肿瘤靶向和供氧调控的协同作用下实现DOX在肿瘤组织的高效富集,在改善缺氧肿瘤化疗耐药的同时对其他主要器官无明显毒副作用,从而实现高效安全的化疗。