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背景乳腺癌(Breast cancer),是全世界发病率仅低于肺癌的最常见恶性肿瘤,已成为20～59岁女性死亡的最主要原因。近年来乳腺癌的发病率在世界各国均处于上升趋势。乳腺癌易复发,且转移性晚期乳腺癌治疗效果极差,并发症重、死亡率高。因此,这就要求人们更加深入的研究乳腺癌发生发展的分子机制以及探求针对乳腺癌更有效的化疗药物。肿瘤干细胞假说认为占非均一肿瘤细胞群中的很小一部分细胞驱使着肿瘤的生长,并增强化、放疗的抵抗。这种新理论为肿瘤的临床治疗提供了新的研究方向。传统的治疗措施可以根除肿瘤组织中的大部分细胞从而使肿块缩小,但仍然有一小部分细胞存活,其具有使肿瘤复发的潜能。这一小部分具有自我更新、无限增殖及分化潜能的细胞被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells, CSCs)。其主要分选方法为利用肿瘤干细胞的功能特性及肿瘤干细胞的表面分子标记物进行分选；培养方法主要为无血清悬浮球囊培养法。这为肿瘤干细胞的进一步研究提供了技术支持。近年来,国内许多研究证实三氧化二砷(As2O3)对白血病、原发性肝癌等多种实体瘤具有较好的疗效。最近有研究表明PML在维持癌干细胞的休眠状态中发挥重要作用。陈竺等研究发现三氧化二砷可以通过直接作用于癌蛋白PML-RAR,使其降解从而根除白血病细胞。因此,研究和探讨三氧化二砷对乳腺癌干细胞的作用及其机制可能为三氧化二砷对乳腺癌的临床治疗提供新的理论依据。目的1.探讨球囊培养富集MCF-7细胞系中乳腺癌干细胞的可行性,并通过流式细胞仪检测所获得CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞的比例。2.通过检测不同浓度As2O3对悬浮球囊培养MCF-7细胞的增殖抑制作用及对细胞周期的影响。3.为As2O3临床应用于治疗乳腺癌提供更多的理论依据。方法1.细胞贴壁培养MCF-7细胞用RPMI-1640培养基(含10%灭活胎牛血清),在37℃、5%CO2的细胞培养箱中常规培养。1～2d换液,3～4d传代。2.细胞悬浮培养收集贴壁培养的MCF-7细胞重悬于DMEM/F12培养基(含B27、20ng/mLhEGF、0.4%牛白蛋白和5ug/mL胰岛素),于37℃、5%CO2的细胞培养箱中悬浮培养,3-4d半量换液,7-10d传代。3.球囊中CD44+CD24-/1ow细胞比例检测收集无血清培养的微球囊,胰酶消化并机械吹打为单细胞悬液,用PBS重悬细胞,每管为1×106/100uL。设实验组和同型对照组。实验组加入CD44-FITC和CD24-PE的单克隆抗体,对照组加入相应的同型对照抗体,室温避光孵育30min, PBS洗涤两次后用500ulPBS重悬,1h内上流式细胞仪检测,重复检测三次。4.球囊细胞存活率测定收集无血清培养的微球囊,胰酶消化并机械吹打为单细胞悬液,细胞计数以5×105/mL细胞浓度接种于超低粘附96孔板,每孔接种4uL,设对照组(未加药组)和实验组,每组设5个复孔,于37℃、5%C02的细胞培养箱中悬浮培养24h、48和72h,采用WST-1还原法检测各实验组细胞的增殖抑制率。实验重复三次。5.细胞周期检测收集无血清培养的微球囊,胰酶消化并机械吹打为单细胞悬液,以1×106/mL细胞浓度接种于超低粘附6孔板,每孔接种8uL,设对照组、2.0umol/L组和8.0umol/L组,于37℃、5%CO2的细胞培养箱中悬浮培养48h,收集各组细胞,胰酶消化并机械吹打制成单细胞悬液,离心后去上清液,加入1mL冰浴预冷70%乙醇,4℃固定12h,0.5mL碘化丙啶染色液染色后24h内完成流式检测。6.观察微球囊形态学采用倒置显微镜观察对照组和实验组48h后微球囊的形态变化。7.统计分析所有数据均采用SPSS17.0统计软件处理,计量资料的描述采用均数±标准差(x±s)表示。多组计量资料的比较采用单因素方差分析：组间两两比较采用LSD检验。检验水准P<0.05时差异具有统计学意义。结果1.悬浮培养结果MCF-7细胞在含细胞因子的无血清培养基中培养呈悬浮球囊形生长,微球囊之间相互分开,传代后仍形成不规则微球囊。2. CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞比例MCF-7乳腺癌细胞贴壁培养和悬浮球囊培养中CD44+CD24-/low乳腺癌干细胞比例分别为(1.83±0.25)%、(60.57±1.91)%,统计分析表明两者差异有统计学意义(F=9.088,P=0.039＜0.05)。3.球囊细胞存活率测定在0.5～2.0umol/L的低浓度范围内,总趋势是随时间的延长球囊细胞的存活率越高(F=36.778,P=0.000＜0.05),表明低浓度As2O3可能诱导乳腺癌干细胞分化并促其增值,在2.0umol/L药物浓度处理48h时球囊细胞存活率最高；在2.0-8.0umol/L的高浓度范围内,总趋势是随时间的延长球囊细胞的存活率越低(F=11.781，P=0.000＜0.05),说明高浓度As2O3可能抑制乳腺癌干细胞的增值；4.细胞周期检测未经As2O3处理的MCF-7球囊细胞中G0/G1、G2和S期细胞比例(%)分别为90.70±1.16、4.97±0.37和4.33±1.09；2.0umol/LAs2O3处理的MCF-7球囊细胞中G0/G1、G2和S期细胞比例(%)分别为56.55±1.44、10.99±0.28和32.46±1.22；8.0umol/LAs2O3处理的MCF-7球囊细胞中G0/G1、G2和S期细胞比例(%)分别为24.51±0.61、56.44±0.96和19.05±0.41,凋亡率为(6.13±0.61)%。经统计分析显示,2.0μmol/L浓度组中各期细胞比例与未加药组各期细胞比例相比较,差异有统计学意义(P<0.05)；8.0μmol/L浓度组中各期细胞比例与2.0μmol/L组各期细胞比例相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.用含细胞因子的无血清培养基在低粘附条件下能有效富集乳腺癌干细胞。2.低浓度As2O3可以诱导MCF-7球囊细胞分化进入分裂增殖期并促其增殖；高浓度As2O3可以抑制已分化MCF-7球囊细胞的增殖并诱导其凋亡。