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目的:采用CIA为RA的动物模型,观察EGCG的治疗作用。采用细胞学和分子生物学方法在细胞和蛋白分子水平分析EGCG对细胞的毒性和免疫调节机制。
方法:
1、采用细胞毒性试验观察EGCG对L929细胞毒性;
2、给予CIA小鼠EGCG治疗,以PBS作为阴性对照,观察各组小鼠的发病情况。对CIA小鼠进行关节评分和关节病灶病理学检测(HE染色)判断EGCG的治疗作用;
3、通过同位素掺入实验,在体内和体外研究EGCG对CIA小鼠CII特异性T细胞的增殖作用来阐明EGCG的治疗作用;
4、通过ELISA检测法,体内、体外研究EGCG对CIA小鼠脾细胞Th1型细胞因子及Th2型细胞因子的分泌水平,探讨EGCG是否通过调节Th1/Th2平衡和抑制促炎细胞因子TNF-α发挥治疗作用;
5、通过Annexin V和PI染色,FACS检测,研究EGCG是否通过诱导CII特异性T细胞凋亡而达到治疗CIA效果;
6、采用流式细胞检测技术观察EGCG对CIA小鼠脾细胞和淋巴结细胞分泌IL-17的影响;
7、采用流式细胞检测技术观察EGCG对诱导CIA小鼠脾细胞和淋巴结细胞Foxp3表达的影响;
8、采用Western-blot方法检测EGCG对IκB、磷酸化IκB蛋白水平的影响。
结果:
1、EGCG对L929细胞无明显毒性;
2、EGCG能够改善CIA的关节评分和关节组织的病理改变,EGCG组关节评分为1.00±0.58与Control组3.58±0.45相比显著改善(p<0.05);
3、在体内和体外实验中EGCG能抑制CIA小鼠T细胞的增殖(cpm:3366±199、5300±330)和Th1型细胞因子IFN-γ(145.2±8.06 pg/ml、50±5pg/ml)和促炎因子TNF-α(369.2±15.4 pg/ml、86.67±5 pg/ml)分泌与Control组(cpm:5342±112、8220±450;IFN-γ;274.2±33.87 pg/ml、77.5±5 pg/ml;TNF-α;508±43 pg/ml、118.3±4 pg/ml)相比有显著差异(p<0.05),对IL-4水平无影响;
4、EGCG对诱导CIA小鼠T细胞凋亡与对照组相比无明显差异;
5、EGCG对CIA小鼠淋巴结分泌IL-17有抑制作用,但对小鼠脾细胞分泌IL-17无影响;
6、EGCG对CIA小鼠脾细胞和淋巴结细胞Foxp3表达无影响;
7、EGCG能提高CIA小鼠脾细胞和淋巴结细胞中IκB的表达,降低淋巴结细胞磷酸化IκB蛋白水平的表达。
结论:
1、EGCG对细胞无明显毒性;
2、EGCG治疗CIA的免疫调节机制为:
1)抑制CIA小鼠T细胞的增殖和Th1型细胞因子IFN-γ和促炎因子TNF-α分泌;
2)抑制CIA小鼠淋巴结细胞分泌IL-17;3)在蛋白水平上诱导CIA小鼠脾细胞和淋巴结细胞中IκB的表达,抑制淋巴结细胞IκB磷酸化,从而抑制NF-κB的活性。