猪链球菌（Streptococcus suis,SS）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是危害我国养猪业的两种重要病原体，均能引起猪的呼吸道疾病。作为引起猪呼吸道疾病综合征（PorcineRespiratoryDisease Complex,PRDC）的两种重要致病菌，猪链球菌（SS）和胸膜肺炎放线杆菌（APP）在临床上常发生混合感染，混合感染强化了病原菌对动物机体的损伤作用，增加了PRDC的发病率和死亡率，对我国养猪业造成巨大经济损失。迄今为止，SS和APP混合感染的致病机制尚不清楚。在自然界中，大多数细菌为适应环境而粘附聚集在固体表面形成生物被膜，生物被膜状态下的细菌相比浮游态细菌，对抗菌药物和宿主免疫系统的敏感性降低，而多种细菌形成的混合生物被膜可能为细菌提供更强的保护。LuxS/AI-2密度感应系统存在于各种革兰阴性菌和革兰阳性菌中，对细菌生物被膜形成能力、细菌运动性、毒力以及耐药性等起着重要的调控作用。LuxS/AI-2密度感应系统的核心是由luxS基因调控的AI-2信号分子，AI-2不仅可以调节细菌种内的信号传递，还可以实现跨菌种的信息交流。本研究通过建立猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌混合培养的体外模型和混合感染的动物模型，探究猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌混合生物被膜的形成及其特性。同时，建立猪链球菌luxS缺失株和胸膜肺炎放线杆菌的混合培养模型，探究AI-2信号分子对细菌混合生物被膜的影响，为有效预防和控制猪链球菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的混合感染提供理论依据。
　　1.猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌混合生物被膜研究
　　建立猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌单独、混合培养模型，通过扫描电镜、激光共聚焦成像，结晶紫染色、活菌计数等方法评估混合生物被膜形成能力。采用几种常见抗生素测定混合生物被膜的耐药性，并利用q-PCR评估单独、混合生物被膜中细菌毒力因子相关基因的表达差异。实验结果显示，体外单独培养时，猪链球菌和胸膜肺炎链球菌都可形成生物被膜，混合培养时，能够形成混合生物被膜。与单独培养相比，混合培养模型中SS和APP的耐药性增强。同时，APP毒力因子相关基因ApxⅠ，ApxⅡ，afuB，apaI和hgbA表达显著上调。SS毒力因子相关基因cps2，gdh，mrp和sly表达上调。结果表明，在特定条件下SS和APP之间可能存在协同的种间作用，并可能在疾病的进展和持续感染中起重要作用。
　　2.猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌混合感染小鼠研究
　　本部分以第一部分实验为基础，建立猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌单独、混合感染小鼠的动物模型。通过测定半数致死量，肺组织载菌量，以及小鼠肺脏炎症因子表达等，比较SS和APP单独以及混合感染对小鼠的致病力影响。结果显示，SS对小鼠的LD50为2.44×107CFU，APP对小鼠的LD50为9.56×106CFU，SS和APP混合感染组的小鼠LD50为5.42×106CFU。相比单独感染，混合感染对小鼠的致死率更高，说明混合感染可能增强了SS和APP的致病力。小鼠肺脏组织载菌量测定结果显示，在混合感染组中，SS的细菌数要显著多于SS单独感染组，说明与APP的混合感染提高了SS对机体的侵染能力和在组织中的定殖能力。小鼠肺脏炎症因子表达实验结果显示：混合感染组的炎症因子MCP和IFN要显著高于单独感染组。说明相比单独感染，混合感染可能引起小鼠肺脏更强的炎症反应。q-PCR结果显示SS和APP混合感染小鼠时，两者毒力因子基因整体上调，说明SS和APP的混合感染可能增强其在体内的毒力。
　　3.外源AI-2信号分子对猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌混合生物被膜的影响
　　建立猪链球菌luxS缺失株和胸膜肺炎放线杆菌的体外混合培养模型，并通过添加外源信号分子AI-2，评估AI-2对SS和APP混合生物被膜形成能力以及耐药性的影响。结果显示缺失猪链球菌luxS基因后，其与胸膜肺炎放线杆菌形成的混合生物被膜显著降低。但当加入外源AI-2后，混合生物被膜形成能力提高。耐药性结果显示，添加外源AI-2，可以提高猪链球菌luxS缺失株和胸膜肺炎放线杆菌混合生物被膜的耐药性。结果表明AI-2可能调节猪链球菌和胸膜肺炎放线杆菌种间关系，对混合生物被膜的形成有重要影响。