克氏原螯虾MafG-like基因克隆及功能分析

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禽肌腱膜纤维肉瘤(Maf)蛋白是一类肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物编码的蛋白质,在氧化应激的重要信号通路—Nrf2/Keap1信号通路中起重要作用。其分为两个亚家族,分别是大Maf(c-Maf,Maf A,Maf B和NRL)与小Maf(Maf F,Maf G和Maf K)。Maf G是典型的小Maf蛋白,其结构与Maf F、Maf K较为相似,三者被认为是Maf-S的同源蛋白。Maf G可以与Nrf2直接结合,识别下游抗氧化基因的启动子中的抗氧化反应原件(ARE),促进其转录,从而促进氧化应激反应。在哺乳类中,关于Maf G在抗癌中的作用有较多研究。然而,在水生低等动物中,Maf G鲜有报道。因此,本文通过克隆克氏原螯虾Maf G基因(PcMafG-like),研究其在抗氧化信号通路中的作用,为克氏原螯虾氧化应激机制及其作为检测重金属的生物标记物提供理论基础。本研究首次克隆了PcMafG-like基因。该基因包含一个483 bp的3’非翻译区,一个111 bp的5’非翻译区和一个246 bp的开放阅读框(ORF),共编码81个氨基酸。结构域分析表明,PcMafG-like有Maf G-like家族标志性的DNA结合的b ZIP结构域,系统进化树发现,PcMafG-like与南美白对虾(Litopenaeus Vannamei)的预测蛋白Maf G-like最为相似(同源性达99%),与其它节肢动物较为相似,与脊椎动物相似性较远。多序列比对分析发现PcMafG-like与其它物种的b ZIP结构域有一定的保守性。通过qPCR检测了PcMafG-like在不同组织中的表达,发现其在检测的几个组织中广泛表达,同时在肌肉中表达最高。为了证明PcMafG-like在参与重金属诱导的氧化应激,分别用不同浓度的铜离子和镉离子刺激克氏原螯虾,发现PcMafG-like基因在各浓度Cu2+/Cd2+刺激下在肝胰腺和鳃中均有显著上调,并在72 h时有较高的表达。PcMafG-like基因的上调幅度随刺激浓度上升而增加。原位杂交实验也得出相似的结论。为了研究PcMafG-like基因在重金属诱导的抗氧化反应中的作用,用ds RNA腹腔注射克氏原螯虾干扰PcMafG-like的表达。结果发现,干扰PcMafG-like抑制了重金属引起的下游抗氧化基因的上调,并且也抑制了抗氧化活性物及抗氧化酶活性的上调。组织切片发现,干扰PcMafG-like加剧了Cu2+/Cd2+诱导的肝胰腺组织损伤。为了研究PcMafG-like的作用机制,克隆了下游关键抗氧化基因CAT的启动子,通过分析发现启动子序列中含有Nrf2/Maf结合位点。亚细胞定位实验发现PcMafG-like-GFP位于细胞核;启动子亲和分析实验发现原核表达的重组蛋白PcMafG-like-His可以在体外与CAT启动子序列结合。
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