论文部分内容阅读
纤维素在自然界中广泛存在，而且含量丰富，是一种可再生资源，对解决能源短缺和资源枯竭具有重要意义。但是，我国的纤维素利用率很低，造成大量的浪费。在纤维素的分解过程中，纤维素酶发挥非常大的作用，将纤维素最终分解为葡萄糖，使得纤维素能够得到充分的利用。嗜热革节孢是一种嗜热真菌，能够产生热稳定性酶，是纤维素的分解者之一。 本研究对来自嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因cbhk和β-葡萄糖苷酶基因bgk进行克隆，并在毕赤酵母中进行表达，得到CBHK和BGK重组酶。对重组酶进行分离纯化， SDS-PAGE电泳检测蛋白分子量，外切葡聚糖酶CBHK的表观分子量为72kDa，大于理论分子量50kDa，可能是糖基化造成的；β-葡萄糖苷酶BGK的分子量大小为55kDa与理论的分子量大小基本一致。 改善酶活性对提高纤维素的降解具有十分重要的作用。基于嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶HiBG的结构，本研究对嗜热革节孢β-葡萄糖苷酶活性位点进口端的12个氨基酸残基进行定点突变。通过同源建模，对来源于嗜热革节孢的外切葡聚糖酶基因进行四个位点的定点突变。并将它们在毕赤酵母中进行了突变基因的高效表达。与野生型外切葡聚糖酶相比，突变体的酶活性都有所降低，其中W163H酶活性降低最多，降低了50％；E429D和Q459T分别降低了40%和35%；突变后W397H活性完全丧失。与野生型β-葡萄糖苷酶相比，所有突变体的酶活力都降低了，其中A260N、F348G、Y179F和F180H酶活性降低较少，分别降低了20%、20%、30%和30%；D237S、L173Q酶活性分别降低了55%和60%；而突变W168H、N335F和W349G的酶活性完全丧失。 在纤维素的分解过程中，β-葡萄糖苷酶起着关键作用，酶的催化存在产物抑制现象，大多数酶都存在产物抑制现象，但是一些酶对葡萄糖具有耐受性。嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶对葡萄糖具有耐受性,但是具体的作用机制尚不清楚。本研究，通过对嗜热革节孢糖苷水解酶第一家族β-葡萄糖苷酶的12个进口端位点进行定点突变，研究这些位点对于嗜热革节孢第一家族β-葡萄糖苷酶酶活性及葡萄糖耐受性的影响。突变L173Q丧失葡萄糖耐受性，突变Y179F在高浓度葡萄糖时丧失葡萄糖耐受性。初步证明进口端位点对于酶活性及葡萄糖耐受性都具有一定的影响，催化活性通道的结构特异性可能是葡萄糖耐受机制。