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目的:本研究旨在围绕ERS介导的糖尿病认知功能障碍（DCI）脑内胰岛素信号通路异常与氨基酸代谢紊乱,从内质网应激、海马神经元细胞凋亡、胰岛素信号通路转导异常、差异代谢物等多角度出发,探究“调脏醒神”电针治疗DCI的作用机制,为针刺干预DCI提供高质量实验证据。同时进一步深化针刺干预DCI的效应机制研究,有利于揭示“调脏醒神”电针作用的科学内涵,为其治疗DCI及优化临床诊疗方案提供依据。方法:1.实验选取9周龄雄性自发型2型糖尿病db/db小鼠为研究模型,通过Morris水迷宫行为学测试评估小鼠的认知及记忆功能,从而筛选出有认知功能障碍的db/db小鼠。将筛选成功的糖尿病认知功能障碍模型小鼠共30只,随机分为“调脏醒神”电针治疗组（Acup）15只,模型组（Mod）15只,同等条件下饲养的15只db/m小鼠为空白对照组（Con）,实验共分为3组。Acup小鼠用自制鼠套进行束缚后,采用“调脏醒神”电针进行治疗,20min/次,1次/天,6次为1个疗程,疗程间休息1天,连续治疗4个疗程;Con和Mod小鼠在相同条件饲养,为与Acup保持一致,同样采用鼠套进行20min束缚。各组小鼠于实验的第22天进行Morris水迷宫行为学测试,行为学检测与“调脏醒神”电针干预同步进行,依次进行隐藏平台实验和空间探索实验,共计6天。记录各组小鼠逃避潜伏期、跨越目标象限的时间及路程、跨越入水象限的时间及路程、穿越平台的次数。2.对一般指标进行检测,包括各组小鼠的体重、血糖、摄食量、饮水量等,并采用Elisa法检测各组小鼠血清中INS、TC、TG的含量,观察“调脏醒神”电针对db/db认知功能障碍小鼠一般指标的干预作用。3.HE染色观测各组小鼠海马CA1区的病理形态、Nissl染色观测海马神经元中尼氏小体的数量及分布情况、TUNEL荧光染色观测海马神经元细胞凋亡比例。4.Western blot法及实时荧光定量PCR法检测小鼠海马组织内质网应激相关分子（GRP78、IRE1α、TRAF2、ASK1）、凋亡相关分子（JNK、p-JNK、Bcl-2、Bax、caspase3）、胰岛素信号通路相关分子（IRS1、p-IRS1、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β）及p-Tau、Aβ的表达。5.应用~1H NMR代谢组学技术结合多元统计分析方法,明确“调脏醒神”电针干预前后db/db小鼠海马内的差异代谢产物、代谢轮廓及差异代谢产物与ERS、认知功能障碍间的相关性。结果:1.一般指标检测结果:（1）摄食量、饮水量:与Con比较,Mod小鼠的摄食量及饮水量均明显增多（p＜0.05,p＜0.01）;Acup经过治疗后,与Mod比较,其摄食量、饮水量均明显下降,有显著性差异（p＜0.05,p＜0.01）;（2）体重、血糖:Mod小鼠的体重和血糖较Con相比均显著升高（p＜0.05）,经“调脏醒神”电针干预后,与Mod比较Acup小鼠的体重、血糖分别在干预的第二周、第三周出现明显降低的趋势,且与Mod相比有显著性差异（p＜0.05）;（3）INS、TC、TG:与Con相比,Mod小鼠血清INS、TC及TG含量均明显升高（p＜0.05,p＜0.01）,Acup与Mod相比,INS、TC、TG含量出现明显下降趋势（p＜0.05,p＜0.01）。2.Morris水迷宫实验:与Con相比,Mod小鼠平均逃避潜伏期明显延长（p＜0.05）。与Mod相比,Acup小鼠平均逃避潜伏期出现缩短的趋势,具有统计学差异（p＜0.05）;穿越平台次数的结果与逃避潜伏期结果一致,经“调脏醒神”电针治疗后,Acup穿越平台的次数明显增加（p＜0.05）;从各组小鼠60秒内穿越平台的次数、入水及目标象限游泳时间和路程的结果中可以观察到,与Con和Acup比较,Mod小鼠在入水象限的游泳时间和路程均明显增长,表现出一定的趋向性,而且从游泳轨迹图中可以看出Con和Acup小鼠在目标象限逗留的时间更长（p＜0.05）。说明“调脏醒神”电针对db/db小鼠的学习及空间记忆有一定的改善作用。3.HE、Nissl及TUNEL染色:（1）HE染色结果显示:与Con相比,Mod小鼠海马CA1区神经元细胞广泛丢失,出现核破裂,核固缩,细胞排列紊乱稀疏,而Acup小鼠海马CA1区神经元细胞少量丢失,细胞核形态相对完整,且排布较整齐;（2）Nissl染色进一步证实了这一变化,与Con相比,Mod小鼠海马CA1区尼氏小体大量丢失,染色较弱,经过治疗后Acup小鼠海马CA1区尼氏小体数量明显增多;（3）TUNEL染色:与Con相比,Mod小鼠海马组织神经元细胞表现出明显的凋亡特征,且凋亡相关蛋白caspase 3及Bax/Bcl-2的比值明显增加,而“调脏醒神”电针治疗后对这种神经元细胞凋亡出现的形态变化有一定的恢复作用,且可以下调caspase 3的表达水平和Bax/Bcl-2的比值。说明“调脏醒神”电针对db/db小鼠的神经退行性改变起到了一定的保护作用。4.db/db小鼠海马存在ERS,并通过启动上游分子IRE1α-TRAF2-ASK1三者形成的促凋亡复合体激活ERS,使分子伴侣GRP78的表达代偿性增加;ERS启动后,激活其下游JNK分子并使其磷酸化,p-JNK导致胰岛素信号通路上的IRS1丝氨酸磷酸化,抑制其酪氨酸磷酸化,引起胰岛素信号通路转导障碍,使其关键下游靶蛋白PI3K、Akt的磷酸化减少,GSK3β的磷酸化表达增多,进而引起认知障碍标志分子Tau的异常磷酸化和淀粉样蛋白Aβ的沉积;而“调脏醒神”电针可以通过干预上述信号的转导,发挥改善db/db小鼠认知障碍的作用。Pearson相关分析结果显示,海马神经元细胞凋亡水平与ERS及胰岛素信号通路关键蛋白的表达呈显著相关（p＜0.05）。5.~1H NMR代谢组学:与Con相比,db/db小鼠海马代谢物发生了显著变化,其中与糖尿病认知功能障碍相关的差异代谢物有22种,“调脏醒神”电针干预后有15种差异代谢物出现了回调的趋势。同时涉及5条主要的代谢途径,包括:氨基酸代谢、神经递质代谢、能量代谢、膜代谢和渗透调节等。将海马内差异表达代谢物与水迷宫相关行为学检测参数做Pearson相关性分析,结果显示代谢物变化水平与db/db小鼠行为学变化存在明显相关性（p＜0.05）,说明db/db小鼠海马内差异代谢物变化与认知功能密切相关;将海马内差异代谢物与ERS标志分子做Pearson相关性分析,结果同样显示海马内差异代谢物水平变化与ERS存在明显相关（p＜0.05）,说明当db/db小鼠海马出现ERS时,其脑内代谢物也发生了变化,并且这种变化与认知功能紧密相关。结论:1.“调脏醒神”电针不仅能够有效改善db/db认知功能障碍小鼠摄食量、饮水量、体重、血糖等一般指标的变化,调节TC、TG及INS的水平,还可明显提高小鼠的学习记忆能力,改善认知功能障碍。2.“调脏醒神”电针能够延缓db/db认知功能障碍小鼠海马神经元的损伤程度,改善神经元细胞形态,从而起到保护神经元细胞的作用,以恢复神经元的正常功能。3.“调脏醒神”电针可以通过调节db/db认知功能障碍小鼠海马ERS水平,抑制JNK活化,减少神经元细胞凋亡蛋白的表达,从而抑制IRS1的丝氨酸磷酸化,使胰岛素信号转导恢复正常,进而使p-Tau及Aβ的表达减少,发挥改善认知功能障碍的作用。4.“调脏醒神”电针可能通过干预db/db认知功能障碍小鼠海马内多种氨基酸代谢产物的变化,进而调节ERS水平,起到改善认知功能障碍的作用。5.“调脏醒神”电针通过抑制内质网应激,恢复胰岛素信号通路的转导,减轻胰岛素抵抗,调节脑内氨基酸代谢产物的水平,从而发挥改善认知功能的作用,这可能是其干预糖尿病认知功能障碍的潜在机制之一。