随着载人航天工程的发展和空间科学实验的深入,航天员和科学家在太空的实验活动日益频繁,而长时间处于太空微重力环境,骨骼系统失去原在地球表面所受的外部力学刺激,导致机体骨代谢紊乱和功能障碍,出现负钙平衡和骨丢失现象,严重威胁宇航员的健康和飞行任务的顺利执行。因此研究失重性骨质疏松及其预防措施,已成为当前空间生物技术和航天医学面临的重要课题之一。中医药防治和骨质疏松临床症状相类似的骨病已有千余年的历史,我国在应用中草药进行航天药物防护的研究上也取得了一定的进展,浩瀚的中医药宝库有待航天医药工作者进一步开发和利用。骨碎补[Drynaria fortunei（Kunze ex Mett.）J.Sm.]为蕨类植物槲蕨的干燥根茎,是骨伤科常用中药,具有补肾强骨、续伤止痛之功效。本课题首先建立大鼠尾悬吊模拟失重性骨质疏松动物模型及大鼠去卵巢模拟绝经后骨质疏松动物模型,然后采用骨碎补总黄酮（DRTF）及其主要成分柚皮苷（naringin）和新北美圣草苷（neoeriocitrin）,观察其对失重性骨丢失和绝经后骨丢失的防治效果,并进一步在细胞和分子水平研究其对与骨质疏松密切相关的成骨细胞的影响及其作用的分子机制。本论文开展的主要研究工作与获得的结果如下:1.骨碎补总黄酮对大鼠失重性骨质疏松的功效首先建立后肢去负荷尾悬吊大鼠模型,然后将大鼠随机分为基础对照组（baseline）,正常对照组（control）,尾悬吊模型组（HLU）及尾悬吊给予骨碎补总黄酮治疗组（HLU-RDTF）,尾吊持续28 d后,收集大鼠血清和尿液,检测相关骨转化指标;收集大鼠骨骼样本,采用三点弯曲法对股骨力学性能进行分析;采用DEXA骨密度仪对骨矿密度（BMD）和骨矿含量（BMC）进行检测;通过Micro CT对股骨干骺端骨小梁微结构进行测定;通过RT-PCR方法检测成骨相关基因的表达。实验结果显示,HLU组大鼠股骨和胫骨BMD显著下降,股骨骨小梁微组织结构明显退化,股骨和胫骨力学性能降低,骨转换率显著增加。HLU-DRTF组股骨和胫骨BMD相对HLU组有升高趋势,股骨和胫骨力学指标有不同程度上升,骨转换率降低,大鼠股骨干骺端骨小梁微结构参数如BV/TV、Tb.Th和Tb.N显著提高,而Tb.Sp显著下降,说明骨组织微结构得到了改善;RT-PCR结果显示DRTF可能对骨形成和骨重建过程中OPG/RANKL/RANK信号通路和Wnt/β-catenin信号通路发挥调控作用。本研究结果显示DRTF对失重性骨丢失有较好的防治效果,具有进一步开发为防治失重性骨质疏松药物的潜力。2.骨碎补总黄酮对去卵巢致大鼠骨质疏松的功效本实验以17-β-雌二醇（E₂）作为阳性对照,通过大鼠卵巢切除术构建绝经后骨质疏松动物模型（OVX）,分组并给予不同浓度DRTF连续灌胃治疗12 w,收集大鼠血清和尿液,检测相关生理生化指标;取大鼠骨组织分别检测骨密度、骨力学性能、股骨干骺端骨小梁微结构等,并研究DRTF对MC3T3-E1前成骨细胞增殖和分化成熟的影响。动物水平研究结果显示,DRTF能阻止雌激素减少引起的大鼠体重增加、骨量减少和骨小梁微结构退化,增加OVX大鼠骨质,降低骨转化率并有效改善骨小梁微结构和骨力学性能,且对子宫和其他器官的无刺激的作用;细胞水平的结果显示,DRTF可以促进MC3T3-E1细胞增殖、分化并明显促进成骨细胞矿化结节的形成。机体所受力学刺激减少或雌激素水平降低均可使骨骼发生不利改变。文献报道尾悬吊模拟失重导致大鼠血清中E₂水平均显著低于正常对照组,本研究结果显示DRTF可有效防治雌激素分泌较少所致的骨质疏松,表明其具有较好的植物雌激素（phytoestrogen）效应,在对抗航天员在失重环境下体内雌激素水平下降,骨流失加剧方面,也具有开发和应用价值。3.骨碎补总黄酮含药血清对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响本实验以MC3T3-E1细胞为对象,研究DRTF含药血清对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化过程的影响。首先取30只SD大鼠随机分为空白对照组和实验组,实验组按150 mg/kg/d的计量给药,对照组喂等体积生理盐水,给药1 w后,将大鼠麻醉并制备含药血清。用含不同浓度（1.25%,2.5%和5%）DRTF的含药血清培养MC3T3-E1细胞,分别检测细胞增殖、分化和钙化结节形成情况。实验结果显示,不同浓度DRTF含药血清培养MC3T3-E1细胞48 h后,与对照组相比,各浓度的DRTF含药血清均可以显著促进MC3T3-E1细胞的增殖;与对照组相比,相同时间内2.5%DRTF含药血清组的碱性磷酸酶活性显著高于其他两组;2.5%DRTF含药血清组骨钙素的含量明显高于对照;2.5%DRTF含药血清可以显著促进MC3T3-E1细胞矿化结节的产生。本研究结果也说明了DRTF以口服方式用药后所得代谢产物中含有促进骨形成的药效成分。4.柚皮苷和新北美圣草苷对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响本部分实验主要研究骨碎补主要成分naringin和neoeriocitrin对MC3T3-E1前成骨细胞的体外药效作用。实验结果显示用药48 h后,naringin在1×10^-88 mol/L¹×10^-66 mol/L显著的促进MC3T3-E1细胞的增殖,neoeriocitrin在1×10^-99 mol/L¹×10^-66 mol/L显著促进MC3T3-E1细胞的增殖。naringin在浓度为1×10^-7 mol/L¹×10^-66 mol/L,neoeriocitrin在1×10^-88 mol/L¹×10^-66 mol/L浓度可显著促进成骨细胞ALP活性,可见neoeriocitrin表现出更强的促进成骨细胞增殖和分化的活性。Naringin(1×10^-7 mol/L)和neoeriocitrin(1×10^-7 mol/L)作用于MC3T3-E1细胞,在成骨诱导第3 d,neoeriocitrin可显著提高OC的含量,第6 d后naringin和neoeriocitrin均可显著提高OC的分泌量,在第9 d和12 d,neoeriocitrin组OC的分泌量显著高于naringin组。Naringin(1×10^-7 mol/L)和neoeriocitrin(1×10^-7 mol/L)对诱导成骨分化的MC3T3-E1细胞连续处理12 d后,naringin和neoeriocitrin组矿化结节的数量显著高于对照组。Naringin和neoeriocitrin均可促进成骨细胞增殖、分化和矿化,其中neoeriocitrin对骨形成表现出更强的促进作用。5.骨碎补总黄酮、柚皮苷和新北美圣草苷对成骨细胞作用机制的研究MC3T3-E1细胞经不同浓度DRTF、naringin和neoeriocitrin和诱导性培养12 h后,提取总RNA并检测成骨相关基因的表达。MC3T3-E1细胞经以含62.5μg/mL DRTF、1×10^-7 mol/L naringin和1×10^-7 mol/L neoeriocitrin的诱导性培养液培养48 h后,提取总蛋白并通过western blotting方法检测OPG/RANKL/RANK信号通路、Wnt/β-catenin信号通路、BMP信号通路和雌激素受体信号通路相关蛋白的表达情况,主要结果如下:DRTF、naringin和neoeriocitrin对Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、c-myc蛋白表达的影响,发现DRTF、naringin和neoeriocitrin对β-catenin蛋白的表达均有显著上调作用,DRTF对c-myc蛋白的表达有上调作用,但没有显著差异。Naringin和neoeriocitrin对BMP信号通路BMP-2蛋白表达有显著上调作用,DRTF、naringin和neoeriocitrin三者均对Runx-2、Osterix有显著促进作用。DRTF,naringin和neoeriocitrin对ERK蛋白表达无明显作用,但DRTF对p-ERK有显著促进作用,naringin和neoeriocitrin对p-ERK有极显著促进作用。DRTF和naringin对P38无明显作用,但DRTF对p-P38有显著上调作用,naringin和neoeriocitrin对p-P38有极显著上调作用。推测DRTF主要通过naringin和neoeriocitrin对MAPK信号通路p-ERK及p-P38发挥作用。DRTF、naringin和neoeriocitrin对ER信号通路ERα和ERβ蛋白的表达均有上调作用,其中DRTF对ERα的表达有极显著促进作用。提示DRTF中多种活性成分可能通过协同作用表现出较强的拟雌激素效应,通过与ER作用,防止雌激素缺乏引起的骨量减少。OPG/RANK/RANKL信号通路的研究结果显示,DRTF、naringin和neoeriocitrin三者均可通过调节成骨细胞中OPG/RANKL的比值抑制破骨细胞的分化和成熟。Naringin和neoeriocitrin可显著上调OPG/RANK/RANKL信号通路OPG的表达,而DRTF不仅显著上调OPG的表达,还显著下调RANKL的表达。说明DRTF可能还存在其它活性成分对OPG/RANK/RANKL信号通路协同作用。综上,骨骼所受力学负荷和血清中雌激素水平是维持骨组织结构完整和功能正常两个非常重要的因素。而DRTF具有较好的类雌激素效应,可以对抗力学负荷减少和雌激素降低所导致的骨质疏松,体外细胞实验证实DRTF通过多条信号转导途径促进成骨细胞分化成熟以及抑制破骨细胞活化来调节骨形成和骨吸收,体现了中药在治疗骨质疏松时具有多靶点、多途径的特点,也提示DRTF及主要单体具有开发为防治失重性骨丢失航天药物的潜力。