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本文首先以冻鲜内蒙古马鹿茸为原料,优化了鹿茸水溶性总蛋白的提取工艺；然后测定了11批来源于不同产地的鹿茸,建立了鹿茸蛋白指纹图谱；最后建立了在线二维液相色谱系统,并将其应用于鹿茸水溶性总蛋白的分离分析中。具体研究内容如下：第一章：1.对考马斯亮蓝显色法进行了方法学考察。线性回归程Y=0.005X+0.046,R2=0.991,线性范围：10ug-100ug。样品平均回收率为83.3%,精密度、重现性、显色稳定性、加样回收率的RSD分别为0.6%、2.8%、1.4%、2.1%,均符合要求。样品在55min内保持稳定。2.在低温条件下,以内蒙古马鹿茸为原料,采用考马斯亮蓝显色法,以鹿茸水溶性总蛋白提取率为指标,确定了鹿茸水溶性总蛋白的最佳提取工艺：选用电动式匀浆机,匀浆3次,每次10s,提取缓冲液Tris-HCl的浓度为50mmol/L, pH值为7。第二章：1.对反相高效液相的色谱条件进行了优化,确定了最佳反相色谱条件：色谱柱：Shodex公司蛋白专用柱；流动相：A:CH3CN(含0.085%的THF), B:H2O(含0.1%THF);梯度洗脱：0-5min-10min-40min (0%A-0%A-35%A-55%A);流速1ml/min;检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：10uL。内标物为溶菌酶。2.对反相高效液相色谱法的精密度、重现性,样品的稳定性进行了考察,以溶菌酶为参比峰,相对保留时间的RSD值在0.17%-1.2%之间,相对峰面积的RSD值在1.0%-8.6%之间,均符合要求,说明该方法的精密度、重现性良好,样品在12小时内保持稳定。3.对11批鹿茸样品进行了测定,建立了鹿茸11批次样品的蛋白指纹图谱,得到了8个共有峰。相似度评价结果显示,除了2号(新疆马鹿茸)和4号’(北京九鹿马鹿茸)的相似度不足0.9之外,其余9批次均大于0.9,说明鹿茸样品中所含蛋白成分相对稳定,含量有很大差别。但从总体上来讲,梅花鹿茸相比马鹿茸所含主要成分含量较高。北京九鹿马鹿茸和其他产地的鹿茸相比,大部分组分的含量较低。4.通过LC-MS连用系统,对内蒙古马鹿茸第一批样品进行了分离测定,通过LC/MSD Trap Software数据分析软件计算分子量,初步认为鹿茸中含有分子量为15109.78、16124.76、16010.95、16353.63、15971.22的五种蛋白。第三章：1.对IEC、SEC的色谱条件进行优化。结果表明,当起始缓冲液Tris-HCl的浓度为30mmol/L, pH为9.06时,IEC对样品的分离效果最好；当流动相选择磷酸缓冲盐,流速为0.4 ml/min,柱温为30℃时,SEC对样品的分离效果最好。2.通过两个六通阀,以预柱捕集形式作为切换接口,构建正交的IEC-SEC、SEC-IEC、IEC-RP、SEC-RP四种在线二维模式。3.对预柱的捕集能力和切换时间进行了考察,实验表明：Guard column for TSKgel G4000 PWXL对一维组分捕集能力较强,IEC-SEC、SEC-IEC二维系统采用峰值切换；RP18-415 4A对一维组分捕集能力较弱,在IEC-RP系统中,第一维的第1、8组分采用峰值前10s切换；其它的第2、3、4、5、6、7组分采用峰值切换。SEC-RP模式中6个一维组分均采用峰值切换方式。4.将建立的IEC-SEC、SEC-IEC、IEC-RP、SEC-RP四种在线二维液相色谱系统应用于分析鹿茸水溶性总蛋白。结果表明：IEC-RP连用模式峰容量最多,分离度最好。其对鹿茸水溶性总蛋白的分离中,第一维的峰容量为8,第二维的峰容量为30,整个系统的峰容量为240个。和一维相比,IEC-RP在线二维连用系统的分辨率和分离度都得到了很大的提高。本论文首次建立了鹿茸蛋白的反相高效液相指纹图谱,为建立鹿茸蛋白的相关质量标准奠定基础,从而更好地控制鹿茸质量。另外,本论文还尝试建立适用于蛋白质分析的二维液相色谱系统,并将此系统应用于鹿茸水溶性总蛋白的分离分析中,为建立适用于蛋白质分析的在线二维液相色谱平台奠定了基础。