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【研究背景】白血病是造血干细胞恶性克隆性疾病,是青少年常见恶性肿瘤之一。近年来,其发病率呈增加趋势,从分子水平阐明白血病的发病机制对白血病的防治具有十分重要的意义。白血病的发生、发展是多基因、多事件累积的结果,其过程涉及到许多瘤基因的激活和/或抑瘤基因的失活。原癌基因活化致癌的经典范例是慢性粒细胞性白血病（CML）特征性的融合基因bcr-abl{由Ph染色体（Philadephiachromosome）即t（9;22）（q34;q11）形成),其融合的mRNA编码具有高酪氨酸激酶活性的蛋白P210,最终导致细胞癌变。随着研究的不断深入,人们发现许多基因异常与白血病结伴而行,如基因突变、缺失、插入、过表达或/和功能失活等等。在这些基因中,有些基因在白血病与实体瘤之间呈现相似的特征如RAS、MYC、p16,有些则表现出不同的表达模式和作用机制。约60%的实体瘤含p53基因突变,它是p53在实体瘤中低表达和抑瘤功能失活的主要原因,而在大多数白血病中p53基因的表达升高,但其突变发生率低（＜20%）,其功能失活也可能与自身突变关系不大。尽管许多基因在白血病发病中的作用及其机制已初步明确,但所有的基因异常仍不能解释全部白血病的发生机制,因此,寻找鉴定新的白血病相关瘤基因或抑瘤基因,并研究其生物学功能已成为当今白血病研究领域的热点之一。BRD7基因是我校肿瘤研究所分子遗传室通过cDNA代表性差异分析方法新近克隆的鼻咽癌侯选抑癌基因,Genbank登录号AF152604。该基因cDNA全长2317bp,开放阅读框（ORF）含651个氨基酸,定位于染色体16q12.1-12.2区。对BRD7基因的前期研究显示BRD7在多数鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系HNE1中表达下调,将该基因稳定转染HNE1细胞后,发现BRD7具有抑制鼻咽癌细胞生长的功能,并通过Ras/MEK/ERK和Rb/E2F两条通路影响细胞周期进程,使细胞停滞于G0/G1期。同时研究发现,BRD7蛋白在HNE1细胞定位于胞核,并能与核转录因子E1B-AP5、IRF2发生交互作用,调节其转录活性。【方法】本研究将采用RT-PCR、免疫组织化学染色、Western blot等方法检测人类不同类型急性白血病和白血病细胞系中BRD7的表达,分析BRD7表达与急性白血病病人临床特征的相关性;应用PCR-SSCP单链构象多态性分析和直接测序法检测BRD7基因点突变或单核苷酸多态性（SNP）,以进一步探讨BRD7基因的遗传变异与急性白血病发生的联系;通过电转染建立瞬时或稳定表达BRD7基因的白血病细胞系K562,并借助荧光蛋白（GFP）标志及流式细胞术分析BRD7基因对细胞周期和凋亡的影响。【结果】第一部分BRD7基因在白血病细胞中的表达及临床意义1.BRD7基因在白血病病人中的表达52例急性白血病患者和32例正常对照的骨髓单个核细胞的总RNA经RT-PCR后均扩增出一条259bp的目的cDNA片段,提示白血病细胞和正常骨髓单个核细胞均表达BRD7。与内参GAPDH相比,急性淋巴细胞白血病患者和急性非淋巴细胞白血病患者之间BRD7的相对表达量无明显差异（P＞0.05）,但病例组BRD7的相对表达量均高于正常对照组,两两比较有显著性差异（t=3.672 P=0.001;t=2.148 P=0.037）。2.BRD7蛋白在白血病病人中的表达利用免疫组织化学SP法检测了7例急性白血病患者和3例正常骨髓对照的骨髓细胞涂片,结果显示在急性白血病患者的骨髓单个核细胞中BRD7阳性表达细胞百分率较高。3.BRD7基因与白血病患者白细胞和血小板数的相关性经Kendall’s tau-b相关分析,结果显示52例急性白血病患者BRD7基因的表达水平与其外周血白细胞数无明显相关性（r=0.086,P=0.376）;与外周血血小板数亦无明显相关性（r=0.011,P=0.912）。4.BRD7基因在血液系恶性肿瘤细胞系中的表达利用RT-PCR检测血液系恶性肿瘤细胞系BRD7 mRNA的表达,结果显示人类白血病细胞系K562、HL-60和Jurkat细胞、人多发性骨髓瘤细胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤细胞系Raji和人永生化的正常淋巴细胞B958均明确表达BRD7,但BRD7基因在K562细胞呈低表达。5.BRD7蛋白在血液系恶性肿瘤细胞系中的表达在人类白血病细胞系K562、HL-60和Jurkat细胞、人多发性骨髓瘤细胞株KM3、人非何杰金淋巴瘤细胞系Raji和人永生化的正常淋巴细胞B958中均存在BRD7蛋白的表达,但在K562细胞BRD7表达水平相对较低。第二部分BRD7单核苷酸多态性分析1.PCR-SSCP初步筛选BRD7基因点突变在30例正常人对照、52例急性白血病患者及30例正常骨髓对照的取样中发现部分样品扩增的基因片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有异常迁移现象,提示BRD7基因的第440～840位碱基可能存在突变或多态性。2.DNA序列分析鉴定BRD7 SNP的基因型DNA测序法成功地完成了BRD7等位基因分型。在BRD7基因编码区（440～840bp）发现了3个cSNP（coding region SNP）,即C657A、C495T和A737G,其中C657A颠换导致其编码蛋白的第181位氨基酸由天门冬酰胺替换为赖氨酸;C495T和A737G多态性偶联发生,前者为同义cSNP,后者使得编码蛋白的第208位氨基酸由谷氨酸置换为甘氨酸。3.BRD7 SNP在白血病和对照中的基因型分布两组中BRD7基因3个SNP位点的基因型均有3种,即纯合子突变型、杂合子突变型和正常型。A737G基因型频率急性白血病组中为AA:11.5%,AG:32.7%,GG:55.8%,A和G等位基因频率分别为27.9%和72.1%;对照组中为AA:38.4%,AG:28.3%,GG:33.3%,A和G等位基因频率分别为53.4%和46.6%。两组中A737G多态性的基因型频率和等位基因频率均存在显著性差异（x2=25.76,P＜0.01）。危险性分析表明,基因型GG和AG的相对危险度分别为5.33和5.86（OR值为1.12和1.23,95%置信区间分别为1.021.23和0.552.77）。C495T与A737G偶联,基因型频率及其分布同A737G。C657A多态性的基因频率在病例和对照中无显著性差异。4.在白血病中A737G三种基因型BRD7 mRNA表达的比较在急性白血病中,BRD7 mRNA相对内参GAPDH的表达量以737GG基因型最高,为0.512±0.192,737AG型最低,为0.467±0.108,但三者间比较无统计学意义（P＞0.05）。第三部分BRD7对白血病细胞系K562细胞周期和凋亡的影响1.BRD7在K562细胞中的亚细胞定位将pEGFP-C2/BRD7表达质粒瞬时转染白血病细胞株K562细胞,利用其表达的绿色荧光蛋白（GFP）介导亚细胞定位,结果显示在K562细胞中BRD7蛋白定位于细胞核,呈细点状、条索状分布,相对均匀,与染色质的分布存在一定程度的相似性。2.BRD7对白血病细胞系K562细胞周期和凋亡的影响分别将pEGFP-C2/BRD7表达质粒和pEGFP-C2空白载体瞬时转染白血病细胞系K562,通过流式细胞术分析发现,在K562细胞系中BRD7既能部分阻滞细胞周期G0/G1→S期的进程,又具有明显的细胞凋亡始动功能。【结论】1.急性白血病病人和正常骨髓对照的骨髓单个核细胞均表达BRD7,且该基因在急性白血病细胞中表达上调。2.BRD7基因参与了急性白血病的发病过程,但BRD7基因mRNA的表达水平与急性白血病患者初治时外周血白细胞计数和血小板计数无相关性。3.血液系恶性肿瘤细胞系K562、HL-60、Jurkat、KM3、Raji和永生化的正常淋巴细胞B958均表达BRD7,其中K562细胞BRD7呈低表达。4.BRD7基因编码区（440～840bp）存在3个SNPs（C657A、C495T和A737G）,其中C450T和A737C偶联,急性白血病病人偶联SNPs突异等位基因频率明显高于正常对照,危险性分析表明基因型AG和GG携带者患急性白血病的可能性高于从基因型,推测该SNPs可能是急性白血病发生的遗传易感因子之一。5.BRD7蛋白在K562细胞中定位于细胞核,并具有阻滞细胞周期进程和促进细胞凋亡的“协同”作用。