目的与意义肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）（简称肝癌）是全球第6位，我国第3位常见的恶性肿瘤。我国肝癌年死亡率占肿瘤死亡的第二位。据国际癌症研究中心（IARC）估计，2000年全球肝癌发病数为56.4万人，其中约55%发生在中国。目前随着原发性肝癌早期诊断、早期治疗的进展，肝癌总体疗效显著提高。但总体上讲，肝癌即使获得根治性切除，5年内仍有60-70%的病人出现复发、转移。以人群为基础的肝癌5年生存率仍然只有5%左右。探索肝癌增殖、转移分子机制对于改善肝癌患者的生存具有重要意义，也是目前肝癌基础研究的热点。既往对肝癌复发、转移的研究主要是集中在肿瘤细胞上，但新近研究表明：肿瘤的发生发展不仅单由癌细胞本身决定，间质细胞与细胞外基质成分构成的肿瘤微环境对癌细胞的生长、浸润和转移同样具有重要作用。肝硬化是肝癌发生发展的主要危险因素，特别在中国，由于HBV病毒的慢性感染，肝癌患者多具有肝硬化基础。大量研究已证实活化态肝星状细胞（activated Hepatic Stellate Cell,aHSC）是肝硬化发生发展过程中的主要影响细胞，而新近的研究表明，aHSC不仅存在于肝纤维化、肝硬化组织当中，也是肝癌的重要间质细胞。1994年Enzan等通过平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）染色发现肝癌基质中有明显的肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）浸润。从此，肝癌中肿瘤细胞与aHSC的生物学行为逐渐受到关注。1999年，Faouzi等首次在体外共培养研究中发现肝癌细胞可以诱导离体肝星状细胞的活化，肝星状细胞的活化程度与肝癌细胞的增殖程度成正相关。近年来对aHSC的进一步研究发现aHSC能够向肝癌基质浸润，通过促进肝硬化癌变，促进肝癌增殖、转移等多种机制，在肝癌的发生发展过程中扮演着非常重要的作用。Amann T等的研究表明aHSC能够通过影响肝硬化的癌变速度，进而影响肝癌的发生发展。Olaso E的研究发现，aHSC通过促进肿瘤增殖、合成粘多糖、分泌基质金属蛋白酶2和肿瘤趋化性因子、生成有关的细胞骨架来促进黑色素瘤在肝转移过程中的运动和浸润作用。但是aHSC通过何种机制影响肝癌的复发、转移，目前暂无定论。新生血管生成是肝癌增殖、侵袭、转移的重要条件，近年来抑制肿瘤血管生成是肝癌研究中的热点。虽然肝癌血供丰富，但目前阻断肝癌血供的常用方法，如TACE并没有达到预期的满意效果，容易造成栓塞不完全、癌组织残留。近年来用于治疗晚期肝癌的靶向治疗药物：Sorafenib（索拉菲尼）目前仅适用于晚期肝癌，且个体治疗效果差异性较大,整体治疗效果远不能令人满意。因此，目前研究认为还存在其他一些与肿瘤血管生成相关的细胞及分子机制尚未发现，降低了目前针对肿瘤血管生成治疗的有效性。现有研究表明，肿瘤所处微环境可能在血管生成中起到重要作用。在肝硬化门静脉高压症的研究中，aHSC已被证实通过促进微血管生成等作用参与了血窦重塑，导致门静脉高压症形成。近年来，越来越多的证据也表明肝脏肿瘤微环境中的aHSC与肿瘤血管生成相关。2003年Olaso发现在肝黑色素瘤转移癌巢间质中，首先出现的是大量aHSC聚集，而随着转移瘤体积的增大，在aHSC聚集的位置才开始出现微血管的形成，且微血管密度与aHSC的数量呈正相关，初步证实了aHSC在肝脏恶性肿瘤血管生成中的重要作用。2010年，Sancho等在体外将aHSC与肝癌细胞共培养后，aHSC的促血管生成基因表达上升，提示aHSC可能参与了肝癌血管的生成。目前有关aHSC影响肝癌复发、转移仍有许多问题未能澄清。例如，在肝癌中aHSC是否与肿瘤血管生成相关？aHSC通过何种方式促进肿瘤血管生成？肝癌细胞是否通过某些机制调控aHSC的促血管生成作用？这些都是亟待解决的科学问题。为解决这些疑问，本课题拟重点研究：①人肝癌标本中aHSC与微血管生成的相关性；②aHSC影响肝癌微血管生成的机制；③肝癌细胞通过旁分泌途径对aHSC促血管生成作用的调控。通过研究肝癌微环境中aHSC对肿瘤微血管生成的影响及其调控机制，从而揭示肝癌复发、转移的机理，为寻找肝癌治疗的新靶点，制定有效的抗肿瘤治疗策略提供理论基础。第一部分人肝癌标本中aHSC与肿瘤微血管的相关性研究一材料与方法1人肝癌标本来源及临床资料的获取所有人肝细胞癌标本均取自手术切除的病例，共20例。取离体后肝癌标本，分为肝癌组织及配对癌旁组织，分别放入无菌冻存管内，在液氮罐中保存。病例临床资料按性别、年龄、肿瘤直径、甲胎蛋白（AFP）、肝炎病毒感染及癌组织分化级别等分组。2制作人肝癌标本石蜡切片将储存的人肝癌组织及配对癌旁组织由液氮罐取出。配制4%多聚甲醛，将组织浸入，固定24小时后将切块放入脱水机中脱水。后在包埋机中石蜡封埋成块。将蜡块切成4um组织片，58℃烘片12小时。3免疫组化法检测人肝癌标本α-SMA、CD34表达组织脱蜡和水化后，进行抗原修复。滴加一抗α-SMA、CD34，室温1小时或者4℃过夜后在37℃复温45min。滴加羊抗鼠IgG抗体-HRP多聚体，室温或37度孵育20~30min。DAB显色试剂盒显色，镜下掌握显色程度。蒸馏水洗，苏木素复染45s。把切片放入乙醇中脱水，每次2min，然后放入100%二甲苯10min透明。使用中性树脂50ul封片，室温保存。4测量人肝癌组织、癌旁组织α-SMA及CD34的表达强度使用计算机专业图像分析软件Image-pro plus6.0，选取平均光密度表示不同标本内的α-SMA、CD34表达强度，分别代表aHSC的密度和微血管密度。每个标本取随机抽取200或400倍镜下3处视野，在同一拍照条件下，测量区域内阳性物质的光密度，并对各样本求其光密度平均数。平均光密度＝积分光密度/图片有效区域面积。5统计学分析所有计量资料以均数±标准差（X±S）表示，应用SPSS10.0for Windows软件处理，采用t检验、方差分析与双变量相关分析，P<0.05为有统计学意义。二结果1肝癌组织中aHSC主要分布在癌血窦周隙，肿瘤纤维包膜、间隔内，而癌旁组织中，aHSC主要分布于肝血窦Disse间隙内。2肝癌组织中CD34阳性的血管内皮细胞主要分布在肿瘤血窦、大血管管壁，与aHSC的分布位置相近。3在肝癌组织中aHSC的密度与患者性别、年龄、肿瘤直径、AFP、感染肝炎病毒类型无关。而在低分化肝细胞癌中，癌巢内aHSC的密度明显高于高、中分化肝细胞癌。4在肝癌组织中微血管密度与患者性别、年龄、AFP、感染肝炎病毒类型无关。肿瘤直径大于5cm的肝癌组织中微血管密度明显较小肝癌内高。低分化肝细胞癌中，癌巢内的微血管密度明显高于高、中分化肝细胞癌。5肝癌组织中aHSC密度与微血管密度正相关。三结论活化态肝星状细胞存在于人肝细胞癌间质中，其在低分化肝癌组织中密度较高。肝癌组织中aHSC的密度与肝癌微血管密度呈正相关。第二部分人肝癌细胞对活化态肝星状细胞增殖、迁移能力的影响一材料与方法1细胞来源（1）人肝癌细胞系：HepG2细胞（购自中山大学实验动物中心）。（2）人活化态肝星状细胞系：LX-2细胞（购自美国ATCC）。2提取HepG2细胞的条件培养基（CM）消化、接种HepG2细胞于75ml培养瓶中，密度为1×106/ml。HepG2细胞在75cm2培养瓶中使用无血清DMEM培养，24小时后收集培养基，1000r/min离心5min，取上清作为条件培养基，分装成1ml，于-20℃冰箱备用。同时在无细胞的培养瓶中置入等量的无血清DMEM作为阴性对照。3MTT法检测HepG2-CM对LX-2细胞增殖能力的影响消化LX-2细胞后用无血清DMEM重悬，接种在96孔板中培养。24小时后每孔加入HepG2-CM100μL，继续孵育。12h、24h或48h后每孔加50μL1×MTT，孵育4小时，使MTT还原为甲瓒。每孔加150μL DMSO使甲瓒溶解。酶标仪在490nm波长处检测每孔的光密度。细胞存活率%=（实验组细胞OD/对照细胞OD）×100。4细胞迁移实验检测HepG2-CM对LX-2细胞迁移能力的影响选用6孔带Transwell上室的培养板，在下室加入800μl HepG2-CM，上室加入100μl LX-2细胞悬液。在孵箱培养24小时后取出上室，使用4%多聚甲醛室温固定，结晶紫染色。湿棉棒擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下观察。显微镜下取9个随机视野计数，统计结果。5统计学分析所有计量资料以均数±标准差（X±S）表示，应用SPSS10.0for Windows软件处理，采用t检测，P<0.05为有统计学意义。二结果1人肝癌细胞系HepG2细胞在复苏后呈现贴壁生长状态，形态呈多角形，生长速度快，培养2~3d即可传代。2人活化态星状细胞系LX-2细胞在复苏后亦以贴壁方式生长，形态为梭形并呈现星状放射，生长速度较HepG2细胞慢，培养3-4d可传代。3与普通培养基相比较，HepG2细胞的条件培养基在不同时间点均能够促进LX-2细胞的增殖。4HepG2细胞的条件培养基能明显促进LX-2细胞的迁移能力。三结论人肝癌细胞在体外对aHSC具有趋化作用，并可促进其增殖，其机制可能是通过肝癌细胞的旁分泌作用实现的。第三部分人肝癌细胞通过PDGF-BB旁分泌机制促进aHSC中VEGF-A表达的研究一材料与方法1细胞来源与培养（1）HepG2细胞及LX-2细胞来源及培养见第二部分。（2）慢病毒载体系统（Tronolab）：为四质粒系统，组成为pGag/Pol、pRev、pVSV-G及Transfer Vector。（3）细胞株293T：慢病毒的包装细胞。购自中科院上海细胞所。（4）菌株：大肠杆菌菌株XL-10，购自Invitrogen公司。2慢病毒载体的构建用于将目的基因PDGF-B构建到载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，该质粒载体和包装质粒和包膜质粒共转293T细胞即可以包装出慢病毒颗粒。3PDGF-BB过表达慢病毒包装重组慢病毒穿梭载体大量抽提扩增，与慢病毒包装系统辅助质粒共转染293T细胞。收集病毒上清，经膜过滤并超速离心后得到高滴度高纯度慢病毒颗粒，进行病毒滴度测定。4感染靶细胞准备HepG2细胞慢病毒感染实验在10cm2培养皿中进行，细胞复苏、培养、传代等步骤按常规进行。4PDGF-BB过表达慢病毒感染胰酶消化对数生长期的HepG2细胞，制成细胞悬液；将细胞悬液铺板于10cm2培养皿中。待细胞长至汇合度50%~60%左右时，按MOI=5~10的比例准备病毒感染滴液3ml。将不同的病毒滴液（空载病毒、PDGF-BB过表达慢病毒）加于细胞培养皿。24小时后，重复进行病毒复染，12小时后更换新鲜培养基。培养1~2天后荧光显微镜下观察感染率。5免疫印迹法检测PDGF-BB过表达水平分别将对照和PDGF-BB过表达HepG2细胞传代在六孔板中，待细胞生长至90%融合时，RIPA裂解液裂解细胞，Bradford法定量蛋白浓度，免疫印迹法检测两株细胞中PDGF-BB的表达水平。6酶联免疫吸附试验（ELISA）测量HepG2细胞培养上清中PDGF-BB浓度每孔分别加入100ul标准品或已稀释的样品。孵育2小时，甩去溶液，清洗5遍。每孔加入100ul第一抗体工作液孵育1小时，洗板5次。每孔加入100ul底物工作液，孵育15分钟，每孔加入100ul终止液，混匀。30分钟内450nm处酶标仪测OD值，绘制标准曲线，计算待测样品浓度。7HepG2细胞及LX-2细胞间接共培养体系的建立在6孔塑料培养板上架起Transwell insert半透膜，建立双层细胞共用培养液而不直接接触的培养体系。接种HepG2细胞于Transwell膜上作为培养体系上层，将LX-2细胞种于6孔塑料培养板的孔底作为培养体系下层，加入含5%胎牛血清的DMEM培养两种细胞，建立HepG2细胞及LX-2细胞间接共培养体系。8免疫印迹法检测LX-2细胞中PDGFR-β及VEGF-A蛋白的表达（方法同步骤5）9使用PDGF-BB中和抗体拮抗HepG2-CM中PDGF-BB蛋白的作用HepG2-CM的收集方法见第二部分。PDGF-BB中和抗体的拮抗浓度为10μg/ml，在HepG2-CM中加入拮抗浓度的PDGF-BB中和抗体后继续孵育24小时，然后将进行下一步实验。10统计学分析所有计量资料以均数±标准差（X±S）表示，应用SPSS10.0for Windows软件处理，采用t检验与方差分析，P<0.05为有统计学意义二结果1在HepG2的无血清培养上清中可以检测到PDGF-BB，其浓度随着培养时间的延长而增加。2在LX-2细胞单独培养情况下，可以检测到PDGFR-β及VEGF-A的表达。LX-2细胞与HepG2细胞共培养之后，LX-2细胞的PDGFR-β及VEGF-A蛋白表达出现上调。3HepG2-PDGF细胞的条件培养上清可以明显促进LX-2细胞中VEGF-A的表达。在PDGF-BB中和抗体的拮抗下，HepG2-CM促进LX-2细胞中VEGF-A表达的作用减弱。三结论体外间接共培养人肝癌细胞与aHSC，aHSC中VEGF-A蛋白表达增加，这一作用可由肝癌细胞旁分泌PDGF-BB作用于aHSC而实现。