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人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63, HCoV-NL63)2004年首次从荷兰被分离鉴定。分子流行病学研究表明,该病毒在多个国家和地区流行,呈全球性分布。该病毒主要感染婴幼儿及免疫功能低下或缺陷的成人,既能感染上呼吸道,引起发热、咳嗽、喉炎等普通感冒症状,又能感染下呼吸道,引起支气管炎、肺炎等急性呼吸道症状。也有研究报道,该病毒感染与川崎病的发生相关。HCoV-NL63是目前已知重要的六种人冠状病毒之一。HCoV-NL63全基因组序列信息截止到2012年5月仅有五株,即3株荷兰株,2株美国株。而该病毒国内株全基因组序列信息、分子结构特征目前还没有相关报道。本研究的首要目的是获得NL63国内株全长基因组序列信息,阐明其分子结构特征,为国内分子流行病学研究提供参考。对NL63国内株遗传变异和系统发生作系统分析,进一步明确HCoV-NL63的基因型以及国内株所在的亚型。另一方面,研究证明HCoV-NL63能够利用与SARS-CoV相同的受体-血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme2, ACE2)入侵宿主细胞。尽管受体相同,但是两者引起的病理反应却有很大差异。本研究拟以NL63病毒作为模式病毒,以HCoV-NL63国内株全基因组序列为基础,构建其全长cDNA的感染性克隆,为深入研究病毒基因组的结构和功能、复制表达调控机理、病毒与宿主的相互作用、致病性等奠定基础。本课题主要研究结果如下：第一,对来自北京儿童医院的32份NL63阳性样本分别进行了总RNA的提取和定量,筛选出病毒拷贝数较高两份样本(编号分别为CBJ037和CBJ123),然后以荷兰株(NL63_Amsterdam)为参考,设计了包含重叠区域、覆盖全长基因组序列的18对引物,通过对病毒RNA提取、RT-PCR、克隆测序并结合3’/5’-RACE技术获得了两株NL63国内株的全基因组序列,阐明了国内株基因组分子结构特征。结合NL63国内株和其他毒株的系统发生分析表明,NL63病毒目前可分为A、B、C、D四个基因型,而国内株处在一个新的基因型,即D型。Bootscan分析表明,国内株与荷兰株和美国株在进化过程中存在着基因重组。第二,在体外通过融合PCR、体外连接的方式获得了NL63国内株全长的cDNA分子。经过体外转录、电转染宿主细胞的方法获得了NL63国内株全长cDNA的感染性克隆。病毒拯救株感染后第7天能够观察到明显的CPE效应,该病毒拯救株命名为ic-NL63。Western blot和IFA实验表明,ic-NL63在宿主细胞内进行了复制和表达。将病毒拯救株连续传代至20代(P20),分别提取P5、P10、P15和P20代的病毒基因组,对引入的分子Marker进行鉴定。结果表明,该分子标记在病毒拯救株传代过程中具有遗传稳定性。第三,为研究ORF3对病毒功能的影响,对其进行了置换,替换为绿色荧光蛋白基因(GFP)。按照同样的方法将带有GFP标签的全长cDNA体外转录本转染宿主细胞,转染后48h即能观察到绿色荧光蛋白的表达。对该重组病毒拯救株连续传代培养,能够观察到CPE效应。Western blot和IFA实验同样表明该重组病毒拯救株在宿主细胞内获得复制和表达,将该重组病毒拯救株命名为ic-NL63-gfp。一步生长曲线实验表明,病毒拯救株ic-NL63和重组病毒拯救株ic-NL63-gfb病毒滴度在感染细胞后第8d达到峰值,分别为105.5TCID50/mL和105TCID50/mL,两者在生长动力学上无显著差异。而荷兰株(NL63_Amsterdam I)病毒滴度在感染后第7d即达到峰值,为106.5TCID50/mL。ic-NL63和ic-NL63-gfp与荷兰株相比在病毒滴度达到峰值的时间上明显滞后且低一个数量级,在生长动力学上存在显著性差异。本研究首次获得了两株HCoV-NL63中国株全基因组序列信息,阐明了其分子结构特征,对其遗传进化作了系统分析,明确了国内株处在一个新的基因型(D型),为NL63国内分子流行病学研究提供参考。构建了人冠状病毒NL63国内株全长cDNA的感染性克隆。通过对ORF3的置换,获得了带GFP标签的重组病毒拯救株,并证明ORF3在细胞培养中为病毒复制所非必需。这为进一步研究NL63病毒基因组的结构和功能、病毒与宿主的相互作用、病毒的致病性以及抗病毒药物筛选等奠定了基础。