L-组氨酸是含有咪唑基团的重要功能性氨基酸,因其具有免疫调节、抗氧化和抗炎等多种生理功能,被广泛用于食品,饲料,医药等行业。但由于L-组氨酸的生物合成途径较长、调控机制复杂,仅通过系统性代谢工程从头改造菌株难度大且短时间内L-组氨酸产量提高并不明显。选育氨基酸结构类似物抗性突变株获得氨基酸产生菌株,仍然是目前氨基酸发酵常规育种的有效方法。然而筛选L-组氨酸产生菌株的工作量大,本研究旨在提高L-组氨酸产生突变菌株的筛选效率。具体研究内容及结果如下:(1)通过ARTP诱变处理野生型谷氨酸棒杆菌ATCC 14067,确定了菌株最佳处理时间为210 s,致死率为93.26%。然后通过全自动高通量微生物液滴培养系统(MMC)结合平板选育组氨酸结构类似物的抗性突变株。使用48孔板发酵初筛及摇瓶发酵复筛,最终从耐受两种组氨酸结构类似3-氨基-1,2,4-三氮唑10 g/L和D-组氨酸8 g/L的抗性突变株中筛选到菌株Cg-F4,该菌株L-组氨酸积累量可达0.561±0.016 g/L,并且传代7次之后,该菌株的L-组氨酸产量可稳定在0.55 g/L左右。(2)为进一步提高L-组氨酸产生菌株的筛选效率,建立了基于L-组氨酸稀有密码子标记与液滴微流控设备相结合的筛选方法。首先通过将两种荧光报告基因egfp和m Cherry序列中编码L-组氨酸的常用密码子CAC全部替换成稀有密码子CAT,发现替换之后的报告基因egfp-RC9和m Cherry-RC6表达水平都显著低于原始基因。并且由于egfp报告基因在L-组氨酸稀有密码子替换数量上的优势。选择egfp-RC9与egfp进行了L-组氨酸回补实验,发现随着L-组氨酸浓度的增加,携带egfp标记的细胞荧光强度没有显著变化,然而携带egfp-RC9标记的细胞荧光强度有显著提高,表明带有egfp-RC9的表达对L-组氨酸的浓度有依赖性,初步验证了egfp-RC9筛选标记的可行性。因此将egfp-RC9标记筛选物导入含有多重结构类似物抗性表型的突变株中,通过MMC将带有标记筛选物的突变菌株生成若干液滴,同时在线观察各个液滴间的荧光变化情况。随着培养时间的增加,各个液滴间的荧光增加速率差异逐渐显现。根据荧光增加速率差异提取液滴摇瓶发酵检测L-组氨酸含量。最后将对应液滴的荧光增加速率与所测得的L-组氨酸浓度进行拟合,确定了液滴的荧光增加速率与胞外L-组氨酸浓度的相关性(r=0.9101;R~2=0.7853),同时筛选到菌株Cg-DL,该菌株产L-组氨酸量为1.299±0.083 g/L。本论文通过将ARTP诱变与MMC结合选育结构类似物抗性突变株,并且建立了基于L-组氨酸稀有密码子标记与液滴微流控设备相结合的筛选方法,提高了抗性突变株的筛选效率,最终获得了具有稳定表现的L-组氨酸产生菌,可为其他氨基酸或者其他代谢产物的产生菌株筛选提供良好的借鉴。