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目的探索骨膜间质干细胞的Wnt/β-catenin信号通路在骨折愈合过程中的作用；DKK1中和抗体是否通过激活骨膜间质干细胞Wnt/β-catenin信号通路而促进骨折愈合。方法1.实验动物：(1)10周龄小鼠胫骨开放性骨折手术后分为DKKl-Ab组(25 mg/kg,皮下注射,一周2次)和对照组(PBS)。(2)10周龄骨膜间质干细胞特异性β-catenin基因敲除小鼠(p-catenin cKO)胫骨开放性骨折手术后,分组同上。2.胫骨开放性骨折模型：小鼠右侧胫骨中部用刀片横行切断后用针头做内固定,腓骨保持完好。术后7、10、14、21、28天后采集胫骨骨折样本做分析。3.Cre重组酶效率检测：为了解PrxlCreER是否能特异性靶标在骨折部位的骨膜间质干细胞,将PrxlCreER转基因小鼠和Rosa26报告小鼠交配,获得PrxlCreER; Rosa26报告小鼠。该小鼠行胫骨开放性骨折手术,他莫西芬诱导时间分别为术前5天、术前2天和术后3天、术后马上连续5天。10天后收集胫骨骨折样本做X-Gal染色分析。4.影像学X线和Micro-CT分析：术后7、10、14、21、28天行X线和Micro-CT,观察小鼠骨痂骨折线、骨密度、骨量等情况。5.生物力学测试：术后10、14、21、28天,检测小鼠骨痂的最大扭力值和硬度值。6. RT-PCR分析：术后7、10、14、21、28天,将小鼠骨痂采集后,提取骨痂RNA,经反转录后,检测软骨相关标志基因(Sox9,Col2al,ColX)和成骨相关标志基因(Runx2, Osterix, Osteocalcin)及Dkkl、β-catenin。7.组织形态学和骨组织形态计量学：术后7、10、14、21、28天采集小鼠骨痂,10%中性甲醛固定3天,14%EDTA脱钙14天,切片行阿尔辛蓝/橙黄G染色观察骨痂愈合情况。同时使用骨组织形态计量学专用软件分析软骨骨痂面积及新生骨组织面积。8.统计学分析：所有实验数据均以均数±标准差(x±s)表示,成组设计多样本均数以单因素方差分析(ANOVA)检验,两组数据间的比较采用t检验。p<0.05被认为所检验的差别有统计意义。结果1.X-Gal染色显示在骨痂部位Cre重组酶的效率约63%。2.影像学X线及Micro-CT结果显示：DKK1中和抗体组小鼠骨折线在术后14、21天非常模糊。而骨膜间质干细胞P-catenin基因敲除小鼠和骨膜间质干细胞P-catenin基因敲除小鼠联合DKK1中和抗体组在术后14、21天时骨折线仍可见。DKK1中和抗体组的骨量在术后14、21和28天明显高于对照组、骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠和骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠联合DKK1中和抗体组。骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠和骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠联合DKK1中和抗体组两组间无明显差异。3.组织形态学和骨组织形态计量学显示：DKK1中和抗体组小鼠软骨骨痂面积在术后7天明显高于其他三组,而新生骨组织面积在术后14和21天明显高予其他三组。骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠骨痂较其他三组小,而且软骨骨痂面积和新生骨组织面积都相对小。骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠和骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠联合DKK.1中和抗体组两组间无明显差异。4.生物力学检测显示：DKK1中和抗体组小鼠最大扭力值和硬度值在术后10、14、21和28天明显高于其他三组,而骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠骨痂在术后10天较对照组脆弱。5.RT-PCR结果显示：DKK1中和抗体组较其他三组在术后7天,软骨相关标志基因(Sox9、Col2al和ColX)都上调,术后14、21和28天成骨相关标志基因上调(Runx2、 Osterix和Osteocalcin),Dkkl在术后7天下调,β-catenin术后7、10天上调。骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠和骨膜间质干细胞β-catenin基因敲除小鼠联合DKK1中和抗体组两组间无明显差异。结论通过一系列的实验,研究分析明确了DKK1中和抗体能促进小鼠胫骨开放性骨折愈合,其促进骨折愈合的机制是该抗体阻断了DKKl,从而激活了骨膜间质干细胞Wnt/β-catenin信号通路,进而骨膜间质干细胞向成骨细胞和软骨细胞分化,促进软骨内成骨而加速骨折的愈合。DKK1中和抗体是一个可用于治疗骨折和骨延迟愈合或骨不愈合,具有极大潜力的合成代谢制剂。