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癌症是我国第二大危害人类健康的疾病,其致死率仅次于心血管疾病.骨肉瘤是我国年轻群体中常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,预后差,易复发及转移,虽然新辅助化疗的实行及外科手术技术的提升,使目前骨肉瘤患者的5年生存率达到62-78%[1].然而,近四十年来,骨肉瘤的治疗仍鲜有有效的进展[2].对于复发、转移的骨肉瘤患者来说,他们的长期生存率仍不能让人滿意.因此找到一种安全性高、有效地抑制骨肉瘤转移的药物仍然是我们努力的方向.BNF是一种天然小分子化合物,来源于一种中药,已报道其抑制肿瘤细胞增殖.然而,目前BNF抗骨肉瘤的活性及的分子机制都未报道.本文旨在探讨BNF的抗肿瘤活性及抗骨肉瘤的作用机制. 目的: 运用现代药理学研究方法对天然小分子化合物BNF抗肿瘤药效活性进行评价,并进一步探讨BNF抗骨肉瘤的作用机制,为今后BNF抗骨肉瘤的研究提供一些参考. 方法: 1.为了评价BNF体外抗肿瘤活性我们设计了以下两个实验: (1)高内涵技术评价BNF对不同肿瘤细胞的增殖活性. (2)CCK8技术检测BNF对不同肿瘤细胞的增殖活性,进一步对BNF的广谱抗肿瘤活性进行评价. 2.为了深入了解BNF体外抗骨肉瘤的作用机制,我们主要从U2OS细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移三个方面探讨.实验设计如下: (1)高内涵分析BNF对U2OS细胞周期的影响;流式细胞术进一步佐证BNF对细胞周期的影响. (2)流式细胞术检测BNF对U2OS细胞凋亡的影响;Western blot技术检测BNF对U2OS凋亡相关蛋白的影响,从蛋白水平上进一步佐证BNF对U2OS细胞凋亡的影响. (3)用U2OS细胞划痕实验反映BNF对U2OS细胞迁移能力的影响. 3.为了了解BNF对肿瘤血管新生能力的影响,我们设计了以下实验: (1)内皮细胞小管形成实验评价BNF对内皮细胞血管新生能力的影响. (2)内皮细胞划痕实验进一步佐证BNF对内皮细胞血管新生能力的影响. (3)小鼠4T1-luc肿瘤模型的体内实验检测BNF抗肿瘤活性,进一步从体内水平反映BNF对肿瘤血管新生能力的影响. 结果: 1.研究内容一BNF体外抗肿瘤活性评价.高内涵技术及CCK8技术结果:BNF显著抑制几种肿瘤细胞(A2780、Hela、MCF7、HepG2、U2OS)增殖,同时对三种正常细胞(EA.hy926、MYO、VSMC)无显著作用;BNF显著抑制几种人源肿瘤细胞(除MDA-M B-231细胞外)增殖,而对几种鼠源肿瘤细胞(4T1-luc、LLC、B16)无此作用. 2.研究内容二BNF抗骨肉瘤的作用机制. (1)高内涵分析及流式细胞术检测骨肉瘤的细胞周期,结果一致:较Control组比,100nM BNF组U2OS细胞周期S期比例显著上升(P<0.01). (2)流式细胞术对骨肉瘤的细胞凋亡的检测,结果:较Control组比,10nM及100 nM的BNF组的U2OS细胞凋亡细胞的比例显著上升(P<0.05,P<0.01);同时Western blot结果:较Control组比,10nM组及100nM组促凋亡蛋白Bax的表达显著上升(P<0.05, P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2的表达显著下降(P<0.05,P<0.01),活化的Caspease-3的表达显著上升(P<0.01,P<0.01). (3)U2OS细胞划痕实验结果:较Control组比,10 nM及100 nM的BNF组内皮细胞的迁移率显著下降(P<0.05,P<0.01). 3.研究内容三BNF对肿瘤血管新生能力的影响. (1)内皮细胞小管形成实验结果:较Control组比,100nM的BNF组形成的网眼的数目显著减少(P<0.01);内皮细胞划痕实验结果:较Control组比,在给药12 h及24 h时,100nM的BNF组内皮细胞的迁移率显著下降(P<0.05,P<0.01). (2)4T1-luc肿瘤模型小鼠的体内实验结果:与Control组比,给药最后一天,BNF高剂量组4T1-luc肿瘤模型小鼠肿瘤的体积、湿重都显著减小(P<0.01,P<0.01),肿瘤发光强度也显著减小;Micro-CT扫描4T1-luc肿瘤小鼠肿瘤周边血管分布情况,发现高剂量组肿瘤周边血管分布较稀疏,且分支血管数显著减小(P<0.05). 结论: 1.研究内容一BNF体外抗肿瘤活性评价.高内涵分析及CCK8细胞活性检测发现:BNF具有对肿瘤选择性高的广谱抗肿瘤细胞增殖的活性. 2.研究内容二BNF抗骨肉瘤的作用机制. (1)高内涵分析及流式细胞术分析骨肉瘤细胞周期发现:BNF诱导U2OS细胞周期S期阻滞. (2)流式细胞术及Western blot技术分析骨肉瘤细胞凋亡发现:BNF诱导U2OS细胞凋亡. (3 )U2OS细胞划痕实验发现:BNF抑制U2OS细胞的迁移.总结:BNF体外抗骨肉瘤的作用机制包括:诱导U2OS细胞周期S期阻滞、细胞凋亡及抑制U2OS细胞的迁移. 3.研究内容三BNF抗肿瘤血管新生能力的活性评价. (1)内皮细胞小管形成实验得出 BNF 抑制血管新生;内皮细胞划痕实验发现:BNF 抑制内皮细胞迁移,进一步佐证BNF抑制内皮细胞血管新生. (2)小鼠4T1-luc肿瘤模型的体内实验发现:1 mg/k g的BNF抑制体内4T1-luc荷瘤的生长.Micro-CT扫描4T1-luc肿瘤小鼠肿瘤周边血管分布情况,发现:1mg/kg的BNF组肿瘤周边血管分布较稀疏,分支血管数显著减少,得出高剂量的BNF体内抑制4T1-luc荷瘤血管新生.总结:BNF抑制体内4T1-luc荷瘤的生长及抑制肿瘤血管新生.