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诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)或绒毛诃子(Terminalia chebula Retz.var.tomentella Kurt.)的干燥成熟果实,是藏药、蒙药等民族药的常用药。诃子味苦、酸、涩,性平,有涩肠止泻、敛肺止咳、利咽降火的功效。由于诃子的药理学作用广泛,在医疗与食品开发等方面具有广阔的应用前景,通过对市场的前期调研,发现当前藏药标准体系建设相对比较滞后,诃子药源较为复杂,其基源植物绒毛诃子在目前市场流通占比较大。关于诃子的药理学研究较多,对于毒理学报道较少,为了临床合理安全用药,本课题第一部分通过小鼠的急性毒性实验与蓄积毒性实验确定绒毛诃子水煎液的毒性及其毒性靶器官,通过对不同啮齿类动物的重复给药毒性实验,确定绒毛诃子水煎液在不同给药剂量下,对大鼠、小鼠的毒性反应。通过前期系统的动物毒理学实验,评价绒毛诃子的毒性。高内涵筛选分析技术拥有自动定量的细胞成像系统,由荧光试剂标记特定的靶点,可以优化成像方案和进行复杂的数据分析,是一种操作简便、灵敏度高、高通量的筛选技术,被广泛应用于中药的活性成分筛选及药物毒性的筛选。本课题第二部分利用荧光染液对相应靶点进行特异性染色,用高内涵细胞成像分析平台和DILI Assay Template联合考察绒毛诃子中10个化合物对HepG2和L02细胞的毒性作用。通过检测细胞数目、DNA 含量、活性氧簇含量(reactive oxygen species,ROS)、线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)的改变、谷胱甘肽(L-glutathione,GSH)水平等 5 个指标,建立了高内涵肝毒性筛选方法,可以筛选出待测化合物对细胞形态、复制、周期、转录、翻译、凋亡等方面的影响,从而判断化合物致肝毒性风险。本文主要从两部分来探讨绒毛诃子的肝毒性及其物质基础,第一部分通过不同剂量、不同给药时间对不同啮齿类动物的毒理实验,确定绒毛诃子的毒性及其毒性靶器官。第二部分采用高内涵筛选技术结合高效液相的方法初探绒毛诃子的毒性物质基础。第一部分确定绒毛诃子的肝毒性1.绒毛诃子的小鼠急性毒性实验通过急性毒性实验确定绒毛诃子的毒性及毒性靶器官。采用14天急性毒性经典实验方法,单次给药后,观察记录实验期间小鼠的体质量变化、生理状态变化以及死亡情况,测其生化指标和肝肾脏器系数,计算其半数致死量。绒毛诃子水煎液的半数致死量LD50为18.93 g/kg,是70kg人最大日用量的147.8倍。高剂量组小鼠临床表现异常,出现腹泻、水样下痢,在给药12h后开始出现死亡,集中死亡的时间在24h-72h之间。结合病理切片和血清生化结果综合来看,实验组中的谷丙转氨酶(alanine amiotransferase,ALT)和谷草转氨酶(aspartatetransaminase,AST)等血清生化结果异常升高,肝细胞肿胀,细胞核增大,胞浆疏松淡染等,表明肝脏出现损伤,推测绒毛诃子的急性毒性实验的毒性靶器官为肝脏。2.绒毛诃子的小鼠蓄积毒性实验通过经典的20天蓄积毒性实验方法,确定绒毛诃子蓄积实验的毒性特点及其毒性靶器官,为慢性毒性实验与其他毒性实验提供参考。蓄积毒性实验得出,绒毛诃子水提物的蓄积系数K>5,为轻度蓄积。在给药后的第二阶段后,小鼠背毛凌乱,腹泻,呆卧少动,雄性小鼠的体质量增长与对照组相比,增长缓慢,有显著性差异。在给药后第四阶段,小鼠出现死亡,存活小鼠进食量减少,活动减少,部分出现腹部轻微鼓胀现象。结合血清生化和病理切片结果,表明绒毛诃子蓄积毒性实验的毒性靶器官为肝脏,与急性毒性实验结果相一致。3.绒毛诃子的小鼠28天重复给药实验通过对小鼠的28天重复给药实验,预测绒毛诃子在小鼠重复给药过程中引起的临床不良反应及判断药物的安全性和毒性靶器官。实验组小鼠分别灌胃绒毛诃子水煎液,高剂量组15 g/kg,中剂量组7.5 g/kg,低剂量组1.5 g/kg,对照组灌胃等体积生理盐水,14天为一个阶段进行一次取材。在连续给药第四天后,小鼠出现死亡,中剂量组的小鼠死亡数量最多,高剂量组死亡数其次。对存活小鼠进行解剖,结合脏器系数和血清生化结果,推测肝脏为其毒性靶器官,与急毒和蓄积毒性实验结果相一致,表明绒毛诃子水煎液对小鼠具有肝毒性。4.绒毛诃子的大鼠28天重复给药毒性实验本研究采用大鼠连续28天灌服绒毛诃子水煎液,而后设置两周恢复期,观察绒毛诃子水煎液可能引起毒性反应的性质、程度、量效和时效关系及可逆性,确定绒毛诃子水煎液对大鼠的毒性及其毒性靶器官。在实验过程中,高剂量组18.9 g/kg、中剂量组9.5 g/kg、低剂量组1.9 g/kg等分别给予相应浓度的绒毛诃子水煎液,对照组灌胃等体积生理盐水。在实验期间,第16天高剂量组雄性出现动物死亡,第18天中剂量组雌性出现死亡,此后未出现大鼠死亡。在重复给药第14天后,实验组的大鼠并未出现肝损伤。在重复给药第28天后,高中低三个剂量组的大鼠的ALT指标与对照组相比,有显著差异,表明可能有肝损伤。在实验恢复期取材,高中低三个剂量组的大鼠生化指标无异常,表明绒毛诃子对大鼠的肝损伤可能有可逆性。第二部分 用高内涵分析技术初探绒毛诃子肝毒性物质基础1.绒毛诃子中的化合物对HepG2和L02细胞的增殖抑制率测定绒毛诃子中的没食子酸、苯甲酸、莽草酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃里拉京、原儿茶素、鞣花酸、诃子次酸、诃子酸、诃子联苯酸对HepG2和L02细胞在不同孵育时间下的增殖抑制率。测定绒毛诃子中化合物在不同给药剂量和不同孵育时间下的吸光度值,计算出对不同细胞的增殖抑制率。结果表明:没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖在给药浓度为200 μg/mL时,对HepG2细胞的生长抑制率为73.96%、93.77%,对L02细胞的抑制率为99.02%和98.98%。综合分析不同化合物对两个细胞系的增殖抑制率,排名前四位的有没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸和诃子联苯酸,均对L02肝细胞和HepG2肝细胞有明显毒性作用,苯甲酸和莽草酸无明显细胞毒性作用。2.HCS技术筛选绒毛诃子对HepG2细胞的毒性作用成分采用高内涵分析技术,对化合物在不同给药剂量下对HepG2细胞的细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量和MMP改变的影响判断其是否超出其安全阈值范围,并对化合物进行肝毒性排序。在DILI Assay TemPlate排序中,排名前四位的为没食子酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸和诃子联苯酸,没食子酸对HepG2细胞的肝毒性最大,超过其阳性对照噻氯吡啶,30 μg/mL为没食子酸致肝损伤的临界浓度。结论为没食子酸致肝毒风险最高,而后由高到低依次为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃子联苯酸、诃里拉京、鞣花酸、原儿茶素、苯甲酸、诃子次酸、莽草酸。3.HCS技术筛选绒毛诃子对L02细胞的毒性作用成分通过高内涵筛选技术分析绒毛诃子中的化合物对L02细胞的毒性作用,并初步探讨毒性化合物的损伤机制。实验结果表明,毒性预测风险排名前五位的为没食子酸、诃子联苯酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃里拉京,与HepG2细胞的筛选结果相一致。没食子酸对L02细胞的肝毒性最大,当给药浓度>10μg/mL时,细胞数目、DNA含量、GSH降低水平、ROS含量和MMP改变等指标都超出其安全阈值。没食子酸致肝毒风险最高,而后由高到低依次为诃子联苯酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、诃子酸、诃里拉京、鞣花酸、苯甲酸、原儿茶素、诃子次酸、莽草酸。4.HPLC检测绒毛诃子中的毒性成分含量用高效液相双波长法建立测定绒毛诃子中诃子次酸、没食子酸、诃里拉京、诃子联苯酸、诃子酸、原儿茶酸等化合物的含量的方法并做方法学考察。绒毛诃子中诃子次酸含量最高,可达38.21 mg/g,没食子酸含量次之,为10.74 mg/g,诃里拉京含量为9.76 mg/g。将测得的成分含量与HCS技术筛选的绒毛诃子中化合物的毒性排序对比,推测没食子酸和诃里拉京为绒毛诃子致肝毒性的物质基础。