研究背景与目的骨巨细胞瘤(giant cell tumor of bone, GCT)是临床上较为常见的原发良性骨肿瘤,约占全部骨肿瘤的6%。骨巨细胞瘤常见于20-40岁人群,好发于四肢长骨的干骺端。尽管被定义为良性肿瘤,骨巨细胞瘤往往表现出极强的侵袭能力,而溶骨性骨破坏是其最为显著的临床特征。溶骨性骨破坏可引起严重骨痛并可导致病理性骨折,是影响骨巨细胞瘤患者生活质量的主要因素。骨巨细胞瘤对放化疗均不敏感,外科手术切除病灶是其最主要的治疗方案。外科切除技术的进展,特别是整块切除方式在临床上的广泛应用使得骨巨细胞瘤的治疗上了一个台阶,但骨巨细胞瘤的术后复发率仍居高不下,最高可达41.7%。鉴于其侵袭性生长方式和术后高复发率,目前倾向于将骨巨细胞瘤定义为交界性或具有恶性潜能的骨肿瘤。溶骨性骨破坏和肿瘤异常增殖是骨巨细胞瘤治疗中的难点,也是影响患者生活质量和整体生存时间的关键影响因素,但其具体的发病机制尚不明确。骨巨细胞瘤起源于骨髓内间叶组织,主要由三种细胞所构成,分别是：破骨细胞样多核巨细胞、梭形基质细胞以及单核细胞。既往研究曾认为多核巨细胞是骨巨细胞瘤的主要效应细胞和肿瘤成分,但近几年来的研究证实梭形基质细胞(spindle- like stromal cells of GCT, GCTSC)才是骨巨细胞瘤中唯一具有无限增殖能力的肿瘤成分并且在骨巨细胞瘤溶骨性骨破坏过程中起到最关键的作用。GCTSC来源于骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSC),而不同于BMSC的是,GCTSC不但借由自身的异常细胞复制能力维持骨巨细胞瘤的过度增殖特性,还可以分泌大量破骨微环境相关细胞因子来诱导多核巨细胞的形成导致溶骨性骨破坏。因此,探索GCTSC如何具备异常增殖以及过度分泌破骨相关因子的能力,对揭示骨巨细胞瘤的发生以及溶骨性骨破坏的分子机制至关重要,对骨巨细胞瘤的预防、治疗以及寻找新的药物靶点具有较高的基础科学及实际应用价值。基质金属蛋白酶13 (matrix metalloproteinase 13, MMP-13)是体内重要的胶原酶,可高效降解软骨中的蛋白多糖,同时还具有降解细胞表面的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原的能力。MMP-13在血管再生、创伤修复、结缔组织病、肿瘤浸润与转移等多个生理病理过程中发挥重要作用,研究证实MMP-13在骨巨细胞瘤中表达量升高并且参与骨巨细胞瘤破骨微环境以及溶骨灶的形成。甲状旁腺素相关肽(parathyroid hormone-related protein, PTHrP)是由甲状旁腺细胞分泌的单链多肽类激素,与甲状旁腺素有着同样的N端结构,通过与甲状旁腺素Ⅰ型受体结合在体内发挥作用。既往研究发现PTHrP在骨巨细胞瘤中表达量升高,并通过调控RANKL (NF-κBligand)、MMP-13、IL-8等破骨相关因子的表达促进溶骨灶的形成,同时PTHrP还通过抑制梭形基质细胞的凋亡增强骨巨细胞瘤增殖能力。Runt转录因子-2 (Runt-related transcription factor, Runx2)是Runt家族重要成员,在成骨细胞分化及骨骼形成过程中发挥重要作用。研究表明Runx2在骨巨细胞瘤中表达量明显升高并通过调控多个因子的表达影响骨巨细胞瘤的发生以及生物学行为。微小RNA (microRNA)是一类平均长度约为22nt的非编码RNA,在体内广泛存在,主要通过与下游靶基因mRNA的3’UTR区域结合并抑制其翻译过程而发挥作用。通过对人类基因组序列的生物信息学分析发现超过三分之一的人类基因可被microRNA所调控。目前microRNA在肿瘤中的作用是国内外基础研究的重点和热点,但其在骨巨细胞瘤中的具体作用机制尚不明确。MicroRNA 126-5p (miR-126-5p)定位于表皮生长因子样蛋白基因内含子区域,研究证实miR-126-5p在肺癌、乳腺癌、肾癌的发生及恶性生物学行为中发挥着重要作用,但它在骨巨细胞瘤中的作用尚未有报道。研究内容与方法选取2011年07月至2012年06月在第二军医大学附属长征医院接受手术治疗的骨巨细胞瘤患者的典型肿瘤标本,另取正常松质骨对照组织进行microRNA基因芯片检查寻找在骨巨细胞瘤中表达量具有明显差异的nicroRNA。利用生物信息学分析查找可能在骨巨细胞瘤中发挥重要作用的miRNA及其潜在靶基因。利用qRT-PCR、分子原位杂交、荧光免疫观测技术检测miR-126-5p在骨巨细胞瘤组织中的表达情况,利用PCR、qRT-PCR、Western blot、ELISA验证MMP-13、PTHrP、 Runx2在骨巨细胞瘤中的表达情况。选取骨巨细胞瘤典型肿瘤标本进行HE及免疫组化染色进一步明确miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2在骨巨细胞瘤中具体表达情况。通过构建荧光素酶活性报告系统以及潜在结合位点的点突变操作明确miR-126-5p对MMP-13、PTHrP、Runx2的调控关系,并向GCTSC细胞以及骨肉瘤MG63细胞转染miR-126-5p mimic和miR-126-5p antagonist进一步明确miR-126-5p对三个靶基因的调控方式。利用Talen技术构建过表达miR-126-5p的骨巨细胞瘤基质细胞稳定株OE-miR-126 GCTSC并对其进行验证。同时利用qRT-PCR、Western blot、ELISA检测OE-miR-126 GCTSC中miR-126-5p、MMP-13、PTHrP、Runx2的表达情况。将OE-miR-126 GCTSC与骨髓单核细胞条件共培养检测破骨细胞分化和多核巨细胞的数目以明确miR-126-5p对破骨细胞分化的影响；利用骨片实验检测niR-126-5p对GCTSC介导的溶骨性骨破坏的影响；利用细胞计数、流式细胞仪、CCK8实验、细胞周期检测观察1miR-126-5p对GCTSC增殖能力的影响。为进一步验证1miR-126-5p在体内对于破骨微环境及GCTSC增殖活性的影响,我们构建了一系列动物模型进行验证。首先我们构建了去卵巢骨质疏松小鼠模型(OVX小鼠模型)检测miR-126-5p对破骨微环境的影响；接着我们利用鸡胚尿膜囊模型检测miR-126-5p对GCTSC增殖能力以及骨巨细胞瘤成瘤的影响；最后我们构建了miR-126-5p特异性敲除鼠全面观察miR-126-5p对于小鼠生长发育过程的影响。研究结果与结论在此项研究中,我们得到了以下结果：1、MicroRNA芯片提示miR-126-5p在骨巨细胞瘤中表达降低,而对肿瘤组织样本qRT-PCR以及分子原位杂交实验发现miR-126-5p在骨巨细胞瘤中的表达量较正常松质骨组织中明显降低,差距具有统计学意义；2、生物信息学分析提示miR-126-5p可能在骨巨细胞瘤中发挥重要作用,而MMP-13、PTHrP和Runx2是其潜在的靶基因；3、qRT-PCR、Western blot和ELISA检测提示MMP-13、PTHrP、Runx2、RANKL、 IL-8在骨巨细胞瘤标本中表达量升高；HE及免疫组化染色发现上述因子是由骨巨细胞瘤基质细胞所分泌的；4、荧光素酶活性检测实验提示niR-126-5p可直接结合MMP-13、PTHrP和Runx2 mRNA 3’UTR区域并抑制其表达,而进一步的转染实验则证实miR-126-5p主要影响MMP-13、PTHrP、Runx2的蛋白水平表达；5、利用Talen技术构建过表达miR-126-5p的骨巨细胞瘤基质细胞稳定株OE-miR-126 GCTSC,该细胞株中miR-126-5p的表达量提升了20倍；6、破骨细胞分化实验中,OE-miR-126 GCTSC实验组破骨细胞分化受到抑制,破骨细胞数目较对照组明显减少,破骨活性明显降低；7、骨片实验中,OE-miR-126 GCTSC实验组骨片骨破坏灶较对照组明显减小；8、增殖实验中,OE-miR-126 GCTSC实验组基质细胞数目明显减少,细胞增殖活性受到抑制；9、OVX小鼠实验中,摘除卵巢后小鼠体内miR-126-5p表达量明显降低,而MMP-13、 PTHrP、Runx2的表达量明显升高,给予外源性miR-126-5p可有效抑制OVX小鼠骨量减少进程,而抑制体内miR-126-5p表达则加重小鼠体内骨质破坏；10、鸡胚尿膜囊实验中,OE-miR-126 GCTSC实验组骨巨细胞瘤瘤体较对照组明显减小,而多核巨细胞数目明显降低；11、我们利用TALEN技术成功构建了12只F1代miR-126-5p特异性敲除鼠,需进一步培养繁殖纯合子miR-126-5p敲除鼠并全面观察miR-126-5p对小鼠成长发育过程的影响。通过上述研究结果,我们证实miR-126-5p作为一个抑癌基因在骨巨细胞瘤的发生以及生物学行为中发挥重要作用,它通过直接调控MMP-13、PTHrP、Runx2的表达影响GCTSC的增殖以及破骨微环境的形成。同时我们也发现miR-126-5p还可以间接调控RANKL、IL-8等多个因子的表达,而MMP-13、PTHrP以及Runx2之间也存在较为复杂的调控关系,因此miR-126-5p在骨巨细胞瘤中的作用也是极其复杂的。