原核表达人巨细胞病毒UL32、UL44基因及其重组蛋白的抗原性研究

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目的:人巨细胞病毒(HCMV)在人群中感染十分普遍,并且对免疫系统发育不全和免疫抑制患者可引起严重并发症。选择HCMV的UL32、UL44基因抗原性好、特异性强的部分基因片段作为目的片段,应用基因工程技术,在 pET-32a质粒上构建 pET-UL32-UL44表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,鉴定表达蛋白的抗原性。  方法:根据Genbank中HCMV的pp150、gp52蛋白序列,利用Protean计算机软件对亲疏水性和抗原性进行分析。选取适合的区段,根据其对应的UL32、UL44基因核苷酸序列设计合成引物。应用PCR技术扩增DNA片段,将其克隆到pGEX-4T-1载体测序,核苷酸序列分析证实其正确性。将pGEX-UL44质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收切下的UL44片段,连接到经过 BglⅡ和EcoRⅠ双酶切之后的pGEX-UL32质粒,得到pGEX-UL32-UL44克隆。将pGEX-UL32-UL44质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切,回收切下的UL32-UL44片段,连接到经过 BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切的pET-32a载体,构建pET-UL32-UL44重组质粒。将重组质粒导入大肠杆菌 BL21(DE3)菌株,诱导表达,纯化目的蛋白,标记HRP,用ELISA捕获法对目的蛋白的灵敏性和特异性进行评价。  结果:本研究成功构建pET-UL32-UL44重组质粒。将重组质粒导入在BL21(DE3)菌株中,经诱导表达后,目的蛋白表达于上清液中。对重组蛋白进行纯化标记后,初步建立了HCMV抗体的捕获法ELISA检测法。检测40份HCMV阳性血清和40份HCMV阴性血清标本,与LIAISON? CMV IgM试剂盒的检测结果比较,具有非常显著的一致性,融合蛋白的灵敏度可达92.5%,特异性可达97.5%,证明了纯化后的重组蛋白具有很好的抗原性。  结论:此重组抗原具有良好的抗原性,为研制以基因工程重组抗原代替传统全病毒抗原的HCMV检测试剂盒打下了良好的基础。
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