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第一部分维生素A对孤独症患儿共患胃肠问题的影响目的:孤独症谱系障碍(Autism spectrum disorder,ASD)是一组以社会交往障碍及狭隘兴趣、重复刻板行为主要特征的神经发育障碍性疾病。ASD发病率在近年来明显增高,已经成为影响儿童健康的最严重问题之一。ASD患儿除了核心症状外,往往同时共患多种其它疾病,胃肠(Gastrointestinal,GI)问题是ASD常见的一种共患病。维生素A(vitamin A,VA)是一种必需的微量营养素,在大脑发育和胃肠功能中均起着重要作用。然而,目前尚无VA与ASD患儿胃肠共患病之间关系的报道。本研究的目的在于探讨VA与ASD患儿胃肠共患病之间的关系,并探讨维生素A缺乏(vitamin A deficiency,VAD)与胃肠共患病同时存在是否加重ASD患儿的核心症状。方法:本研究共纳入323名2-7岁ASD儿童(男性274名,女性49名)和180名年龄和性别相匹配的正常儿童(男性142名,女性38名)。所有入组儿童由经过统一培训的儿童保健科医师进行体格测量。使用儿童孤独症评定量表(Childhood autism rating scale,CARS)、社交反应量表(social responsiveness scale,SRS)和孤独症行为量表(Autism behavior checklist,ABC)对ASD患儿症状进行评估。所有纳入儿童的照顾者完成一份包括一般人口统计信息、病史及胃肠症状的调查问卷。采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)对儿童血清视黄醇(VA)水平进行检测。结果:ASD组患儿体重、身高均明显低于对照组(p<0.05),但体重指数(body mass index,BMI)在两组之间差异不显著。ASD组患儿血清VA浓度显著低于对照组(p<0.01),且重度ASD患儿血清VA水平低于轻-中度ASD患儿(p<0.01)。另外,ASD组胃肠症状发生率(48.3%)显著高于对照组(20.0%)(P<0.01)。ASD组患儿便秘、腹泻、腹痛、恶心呕吐及大便恶臭发生率均明显高于对照组(p均<0.05)。并且,ASD组患儿最常见的胃肠症状是便秘(32.5%)。对有无各种胃肠症状的ASD儿童的VA水平进行比较,结果显示有总胃肠症状和便秘的ASD儿童血清VA水平显著低于无相应胃肠症状的ASD儿童(P均<0.01)。另外,VA水平与CARS、SRS和ABC评分有关,而胃肠症状与SRS和ABC部分项目评分有关。VAD与胃肠症状对SRS和ABC评分存在交互作用,当VAD和胃肠症状同时存在时ASD患儿SRS和ABC部分项目评分显著增高。结论:ASD患儿的VA缺乏率和胃肠症状发生率均高于对照组儿童。低血清VA水平与ASD儿童的胃肠共患病(尤其是便秘)有关。VAD的ASD患儿的核心症状更重,有胃肠共患病的ASD患儿与没有胃肠共患病的ASD患儿比较有更严重的核心症状。VAD和胃肠道症状同时存在时,ASD儿童的核心症状进一步加重。我们推测VAD可能与有胃肠共患病的ASD有关。第二部分维生素A缺乏对孤独症模型大鼠肠神经系统及胃肠功能的影响及可能机制目的:ASD的临床表现具有高度的异质性。由于许多ASD患者共患胃肠问题,有胃肠问题的ASD被认为是ASD的一个亚型。VA在中枢神经系统和外周神经系统的发育中均起着重要作用。我们在第一部分人群调查中发现VAD的ASD儿童的核心症状更重,并且血清VA水平与ASD儿童的胃肠共患病(尤其是便秘)有关。然而,在ASD儿童中VA水平与胃肠共患病相关的机制尚不清楚。肠神经系统(enteric nervous system,ENS)在胃肠运动等胃肠功能中起着重要作用。在这一部分中,我们通过构建不同VA水平的孤独症大鼠模型,以探讨VAD对孤独症模型大鼠孤独症样行为、胃肠功能和ENS发育的影响,并探讨VAD影响ENS发育的可能机制。方法:不合并VAD的孤独症模型的建立:9周龄雌性大鼠与正常雄性大鼠进行合笼。在孕12.5天,随机给予孕鼠腹腔注射600 mg/kg的丙戊酸钠(valproic acid,VPA)或等量生理盐水,所产的仔鼠即为VPA组和CON组用于后续实验。合并VAD的孤独症模型的构建:4周龄雌性大鼠随机分为VAN和VAD组,分别给予VAN或VAD饲料喂养,4周后取大鼠尾血,检测血清VA水平;然后,将血清VA浓度达到相应水平(VAN≥1.05μmol/L;VAD<0.70μmol/L)的大鼠与正常雄性大鼠进行合笼,所有孕鼠于孕12.5天给予腹腔注射VPA;将VAD组孕鼠随机分为两组,所产的子代大鼠分别为VAD+VPA组和VAS+VPA组,VAN组孕鼠所生仔鼠为VAN+VPA组,在整个研究过程中,VAN+VPA组和VAD+VPA组分别接受VAN饲料和VAD饲料喂养,VAS+VPA组大鼠从出生开始给予VAN饲料喂养,并且在生后(postnatal day,PND)第1天到第7天通过灌胃补充3倍推荐摄入量(recommended nutrient intake,RNI)的VA(83.33iu/天)。从PND 43开始使用ANY-Maze视频跟踪系统对各组大鼠进行包括三厢实验、旷场实验、水迷宫检测或巴恩斯迷宫试验的行为学测试;通过灌胃的方法给予胭脂红检测大鼠全胃肠通过时间;实验大鼠于8周龄时处死,并收集血清和结肠组织,使用HPLC测定大鼠血清视黄醇浓度;定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测PGP9.5在结肠组织中的m RNA表达水平;Western blotting检测结肠组织Claudin1、Occludin、Zo-1、RARα、Ret和PGP9.5蛋白表达水平;使用免疫荧光法检测RARα、Ret、PGP9.5和tuj1在大鼠结肠中的分布和表达;用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)分析RARα与Ret基因的相互作用。结果:VPA组大鼠表现出重复刻板行为和社会交往障碍,水迷宫检测结果也提示VPA组大鼠学习记忆能力下降。VPA组大鼠肠道屏障功能相关Claudin1、Occludin蛋白表达下降,且全胃肠通过时间显著长于对照组(P均<0.01)。VPA组大鼠结肠PGP9.5的m RNA和蛋白表达水平明显低于对照组(P均<0.05)。免疫荧光的结果显示VPA组大鼠结肠内PGP9.5所染的肠神经明显减少。VAD+VPA组大鼠生后各个时间点血清VA水平均显著低于VAN+VPA组(P均<0.01);VAS+VPA组大鼠在出生时血清VA水平与VAD+VPA组相似,从PND3开始各时间点血清VA水平均显著高于VAD+VPA组(P均<0.01)与VAN+VPA组无显著差异(P均>0.05)。在旷场试验中,VAD+VPA组大鼠较VAN+VPA组自我梳理时间及排泄次数有增加趋势,但统计差异不显著(P均>0.05),VAD+VPA组在中央区探索的时间显著低于VAN+VPA组(P<0.05);与VAD+VPA组相比,VAS+VPA组在旷场中自我梳理时间和排泄次数均有下降趋势,但两组差异均不显著(P均>0.05),VAS+VPA组在中央区的时间较VAD+VPA组有增加的趋势,但与VAD+VPA组及VAN+VPA组均差异不显著(P>0.05)。在三厢试验中,大鼠在陌生鼠与玩具之间偏好测试结果显示:VAD+VPA组大鼠在玩具箱中的时间显著长于VAN+VPA组而在陌生鼠箱中的时间显著短于VAN+VPA组大鼠(P均<0.01),VAS+VPA组大鼠较VAD+VPA组在玩具箱中的时间显著减少而在陌生鼠箱中的时间显著增加(P均<0.05)而在各箱活动时间与VAN+VPA组大鼠无显著差异(P>0.05);在陌生鼠与熟悉鼠之间社交偏好的测试结果显示:VAD+VPA组大鼠较VAN+VPA组在熟悉鼠箱中的时间显著增多而在陌生鼠箱中的时间明显减少(P均<0.05),VAS+VPA组较VAD+VPA组大鼠在熟悉鼠箱中的时间显著减少而在陌生鼠箱中的时间显著增多(P均<0.05),而与VAN+VPA组在各箱的时间相似(P>0.05)。巴恩斯迷宫试验结果显示:在训练结束后第1天及第3天的测试中,VAD+VPA组大鼠找到目标洞的时间均显著长于VAN+VPA组,且探错洞口的次数均多于VAN+VPA组(P均<0.01);VAS+VPA组大鼠较VAD+VPA组在两次测试中找到目标洞的时间均显著下降(P均<0.01)而探错洞口的次数均有减少趋势,但只有训练结束后第3天的测试中探错洞口的次数较VAD+VPA组减少显著(P<0.05),两次测试中VAS+VPA组找到洞口的时间及探错洞口的次数均与VAN+VPA组无显著差异(P均>0.05)。VAD+VPA组大鼠结肠组织肠道屏障功能相关的Claudin1、Occludin及Zo-1蛋白水平均显著低于VAN+VPA组和VAS+VPA组大鼠(P均<0.05)。全胃肠通过时间测试结果显示,VAD+VPA组大鼠全胃肠通过时间显著长于VAN+VPA组(P<0.001),VA补充后全胃肠通过时间恢复至与VAN+VPA组相似(P>0.05)。VAD+VPA组大鼠结肠组织RARα、Ret和PGP9.5蛋白表达水平均显著低于VAN+VPA和VAS+VPA组大鼠(P均<0.05)。另外,免疫荧光结果也显示,VAD+VPA组大鼠结肠组织RARα、Ret和肠神经标志物PGP9.5以及tuj1均明显低于VAN+VPA和VAS+VPA组大鼠。Ch IP实验结果提示,RARα在结肠组织Ret基因启动子区域富集,并且这种富集在VAD+VPA组较VAN+VPA组显著降低(P<0.01)。结论:VPA诱导的孤独症模型大鼠肠道屏障功能受损,全胃肠通过时间延长,并且有ENS发育异常。孕期开始的VAD加重孤独症模型大鼠孤独症样行为(尤其是社会交往障碍),肠道屏障功能和胃肠动力损伤,以及ENS发育障碍。补充VA可显著改善VAD的孤独症模型大鼠的孤独症样行为,肠道屏障功能及胃肠动力损伤,以及ENS发育障碍。VAD加重ASD模型大鼠ENS发育障碍可能是由于RARa在肠道的表达下降,RARa与Ret基因启动子区域结合减少,Ret信号通路表达下降所致。因此,我们推测VAD可能同时导致ASD个体的大脑和ENS的损伤。孕期开始的VAD可能导致个体更易受ASD相关危险因素的影响,增加有胃肠共患病的ASD亚型的发病风险和症状。