【摘 要】
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背景和目的2019冠状病毒病（COVID-19）,是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一种严重危害人类健康和社会发展的急性呼吸道传染病,其传染性强、潜伏期长、人群普遍易感,临床症状以发热、干咳、乏力为主,严重者并发急性呼吸窘迫综合征。病毒核酸检测（NAT）是诊断COVID-19的“金标准”,但在实际检测过程中,核酸检测耗时长,对样品保存、检测设备、实验室环境和操作人员的专业要求均较高,且
【基金项目】
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国家自然科学基金面上项目（No.31970886）； 广东省自然科学基金杰出青年项目；
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背景和目的2019冠状病毒病（COVID-19）,是由新型冠状病毒（SARS-CoV-2）引起的一种严重危害人类健康和社会发展的急性呼吸道传染病,其传染性强、潜伏期长、人群普遍易感,临床症状以发热、干咳、乏力为主,严重者并发急性呼吸窘迫综合征。病毒核酸检测（NAT）是诊断COVID-19的“金标准”,但在实际检测过程中,核酸检测耗时长,对样品保存、检测设备、实验室环境和操作人员的专业要求均较高,且容易出现假阴性。因此我们迫切需要一种快速、简便、敏感、可靠的检测手段,能早期筛查和诊断新冠病毒的感染,及时控制疫情的传播。本研究通过制备抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白（NP）的单克隆抗体和铂包金纳米颗粒（Au@PtNPs）,开发一种基于智能手机的纳米酶联免疫传感器（NLICS）,用于快速、灵敏、便捷、定量地检测人血液样本中的SARS-CoV-2 NP抗原。方法采用传统的单克隆杂交瘤细胞制备技术和间接ELISA的方法筛选并制备NP的特异性单克隆抗体;通过双抗体夹心ELISA的方法筛选NP的配对抗体。通过还原法制备Au@PtNPs,并用Au@PtNPs标记配对抗体中的检测抗体,而后喷涂于结合垫上;将配对抗体中的包被抗体用划线仪固定在NC膜的检测线（T线）上。按顺序将样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸组装于特制的U型槽中,组装成纳米酶联免疫传感器的免疫层析装置,即U型ICA。将U型ICA与阅读装置和光度计组装在一起,并通过蓝牙与智能手机连接,集合成基于智能手机的纳米酶联免疫传感器。将传感器应用于21例临床新冠阳性样本检测和80例健康献血者血浆样本筛查,并与商业化抗原检测试剂盒对比,评估NLICS的检测性能,以期望将其应用于大规模的人群新冠抗原检测筛查。结果1.前期制备得到了 5株抗体效价高和特异性好的NP单抗隆抗体,并筛选得到一对敏感性强、特异性高的配对抗体,分别是包被抗体4G11、检测抗体5E4。2.通过对NP标准品的检测,NLICS的检测线性范围是0.05-1.6ng/mL,检测限是0.026ng/mL,优于传统的免疫层析检测卡（ICA）（检测限是0.1 ng/mL）。NLICS的批内差和批间差分别小于10%和15%。传感器具有较高的可靠性、稳定性和可重复性,且只需25min即可得到检测报告。3.在21例临床新冠肺炎阳性患者血清样本的检测中,NLICS检测出16例阳性,5例阴性,即NLICS的敏感性为76.2%,准确性为95.1%;商品化抗原ELISA检测试剂盒检测出10例阳性,11例阴性,即ELISA的敏感性为47.6%,准确性为89.1%。在80例阴性健康献血者血浆样本检测中,两种方法的检测结果均为阴性,即NLICS和ELISA的特异性均为100%。NLICS的各项性能优于商业化ELISA试剂盒。结论基于智能手机的纳米酶联免疫传感器具有较高的敏感性、准确性和稳定性,实现了 SARS-CoV-2NP抗原的快速、定量检测。作为COVID-19诊断方法的补充和创新,NLICS是一种可靠、简便、灵敏、低成本、可定量的即时检测方法（POCT）,适用于疑似SARS-CoV-2感染的筛查以及患者体内SARS-CoV-2NP含量的动态监查。创新之处1、制备出并筛选出敏感性高、特异性强的抗新冠病毒核衣壳蛋白的单克隆配对抗体,分别是4G11抗体株和5E4抗体株。2、开发的NLICS结合智能手机,能特异性检测人血液中的SARS-CoV-2NP抗原,检测耗时短,并且能够提供定量的检测结果,其研究成果已在Sensors and Actuators:B.Chemical 上发表（2021）。
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