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传染性脾肾坏死病毒病(infectious spleen and kidney necrosis virus disease,ISKNVD)是由传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)引起的以脾、肾坏死为主要特征的疾病,可引起淡水养殖鳜的暴发性死亡,给我国乃至世界鳜鱼养殖业带来了非常严重的经济损失。疫苗接种是预防水生动物病毒性疾病的有效方法之一,但鱼类的生物屏障作用使得浸浴疫苗在不添加佐剂和载体的情况下并不能达到最佳的效果,纳米载疫苗靶向递呈技术的研究有助于开发能够突破鱼类生物屏障从而发挥高效作用的渔用浸浴疫苗。因此,本研究以功能化修饰的碳纳米管作为载体结合甘露糖糖基化修饰主衣壳蛋白(MCP)抗原蛋白,构建了靶向性碳纳米管载疫苗系统,对疫苗系统进行了鉴定和安全性评价。采用浸浴免疫的方式对鳜进行免疫,评价疫苗系统对ISKNV的免疫保护效果,进行疫苗系统的免疫增效研究,最后对免疫方案进行了优化。主要包括以下几个方面:1.靶向性碳纳米管载疫苗系统研究通过基因工程技术制备MCP抗原蛋白,采用功能化甘露糖对抗原蛋白进行糖基化修饰,结合化学修饰技术以功能化碳纳米管作为载体构建靶向性碳纳米管载疫苗系统(SWCNTs-M-MCP),其中MCP抗原蛋白约占35.2%,功能化甘露糖约占4.1%。安全性评价显示,鳜(3.00±0.25 g)经10、20、40 mg/L疫苗系统处理28 d后,活动正常,存活率均在98%以上,与对照组相比生长性能、脂肪酶和淀粉酶的活性、肌肉生长发育相关基因表达水平(Myostatin、Myo D、Myogenin)均没有显著影响。本研究构建的防治传染性脾肾坏死病毒病靶向性碳纳米管载疫苗系统,对鳜的安全性没有显著影响。2.靶向性碳纳米管载疫苗系统免疫效果研究通过浸浴方式使用靶向性碳纳米管载疫苗系统对鳜(6.00±0.50 g)分组进行免疫,检测相关的免疫指标变化,如血清抗体效价和免疫相关基因表达等,并结合传染性脾肾坏死病毒攻毒试验评价靶向性碳纳米管载疫苗系统的免疫效果。结果显示:和对照组以及其他处理组(MCP和SWCNTs-MCP组)相比,疫苗系统浸浴免疫处理后,SWCNTs-M-MCP组的血清抗体效价水平、免疫相关生理指标(ACP、AKP、SOD、C3)以及免疫相关基因表达水平(TNF-α、Mx、IRF-1、Ig M、IL-1β、IL-8)均显著上调,SWCNTs-M-MCP的最高浓度组(20 mg/L)中TNF-α的表达量上调最高,达到对照组的16倍多,而在相同浓度SWCNTs-MCP组中仅为对照组的11倍左右。ISKNV攻毒结果显示SWCNTs-M-MCP的最高浓度组的相对免疫保护率是最高的,为81.3%,而SWCNTs-MCP的最高浓度组的相对免疫保护率仅有69.6%。靶向性碳纳米管载疫苗系统通过浸浴免疫可以有效提高鳜对ISKNV的免疫应答反应和免疫保护效果。3.靶向性碳纳米管载疫苗系统免疫增效研究我们利用异硫氰酸荧光素(FITC)对疫苗系统进行了荧光标记,通过组织切片、免疫荧光等技术探究了疫苗系统在鳜巨噬细胞和组织中的靶向作用和递呈规律。结果显示:鳜巨噬细胞、脾脏和肾脏组织对SWCNTs-M-MCP的摄取量显著高于其他疫苗组(MCP、M-MCP和SWCNTs-MCP)。在鳜巨噬细胞中,SWCNTs-M-MCP的摄取量显著高于其他疫苗组,达到了MCP组的9倍多。活体成像结果显示SWCNTs-M-MCP在浸浴免疫0.1 h就可以进入鳜体内,随着浸浴时间延长,进入鳜体内的SWCNTs-MMCP的含量也逐渐增加,并主要集中在内脏组织器官。靶向性碳纳米管载疫苗系统通过提高疫苗进入体内的含量,增强抗原呈递反应,从而增强疫苗的免疫保护效果。4.靶向性碳纳米管载疫苗系统免疫方案优化研究本研究从疫苗的免疫时间(4、8、12 h)、免疫浓度(1.25、5、20 mg/L)和免疫密度(8、16、32尾/L)三个方面设计了正交试验对疫苗系统的免疫方案进行了优化。从攻毒后的免疫保护率结果可知,当免疫时间、免疫浓度和免疫密度分别为8 h、20mg/L、8尾/L时,免疫保护率最高,为86.7%。血清抗体效价、免疫相关生理指标和免疫相关基因表达水平的也得到了相同的结果。我们确定最优的免疫方案为鳜(3.00±0.25 g)经疫苗浸浴免疫8 h,免疫剂量20 mg/L,免疫密度8尾/L。综上所述,本研究构建的靶向性碳纳米管载疫苗系统通过提高疫苗的穿透性和靶向性,进而提高疫苗进入鳜体内的含量,增强疫苗的抗原呈递反应,从而提高疫苗系统对ISKNV的免疫保护效果。本研究将为其它水产动物纳米载疫苗系统提供新的思路,在水产养殖和水产品食品安全生产中具有广阔的前景。