临床和基础研究结果显示,果糖过量摄入可诱导代谢综合征与非酒精性脂肪病,并加重肝纤维化进程等肝损伤,因此,加强其病理机制和药物干预研究尤显重要。氧化应激是其中病理发展关键环节,核转录因子E2相关因子2(Nrf2)从Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keapl)解离转移进入细胞核,可启动多种抗氧化酶以抵抗氧化应激。MicroRNA200a(miR-200a)参与机体氧化应激调控过程,Targetscan5.2数据库预测miR-200可与Keap1 mRNA3’非编码区(UTR)结合。本课题组前期研究证实高果糖所产生的活性氧簇(ROS)可触发硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)过表达,激活NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体,引起肝脏炎症及脂质蓄积等肝损伤。高果糖是否影响miR-200a表达及Keap1/Nrf2通路使ROS过度生成而引发肝脏炎症和脂质蓄积?值得探寻。另一方面,转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads信号通路激活参与肝细胞上皮间充质转化(EMT)促进肝纤维化,survivin可正向调控TGF-β1引起癌细胞EMT。已报道在四氯化碳诱导动物肝纤维化组织中miR-200a表达水平降低,miR-203也在多种纤维化组织中呈现低表达。据Targetscan和starBase v2.0数据库预测miR-200a和miR-203均可与survivin mRNA 3’UTR结合。而核转录因子锌指E-盒结合同源异形盒蛋白1(ZEB1)入核可抑制miR-200a和miR-203转录水平。由此,本文进一步思考,高果糖能否引起ZEB1核转位而影响miR-200a和miR-203转录水平,这一过程是否有可能增强survivin对TGF-β1/Smads信号通路的激活以促进肝细胞EMT与肝纤维化?虎杖苷是中药虎杖主要有效成分之一。在临床上,虎杖具有良好的肝保护治疗效应。实验药理学研究结果也显示出虎杖苷具有肝保护作用。然而,虎杖苷能否改善代谢综合征病理特征与肝损伤?及其可能新的分子作用机制等尚需进一步研究。一、虎杖苷改善高果糖诱导大鼠产生代谢综合征和肝损伤病理特征本文在课题组前期工作基础上,建立了高果糖代谢综合征大鼠模型,并灌胃给予虎杖苷(7.5、15和30 mg/kg)、吡格列酮(阳性对照药,4 mg/kg)。口服葡萄糖耐量试验(OGTT)与胰岛素耐量试验(ITT)证实虎杖苷和吡格列酮可增强模型动物葡萄糖耐量与增加胰岛素敏感性。观察到虎杖苷和吡格列酮可降低模型动物血清胰岛素、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-c)、白介素1β(IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平、以及肝损伤指标血清谷草转氨酶(AST)与谷丙转氨酶(ALT)活性;并减轻肝组织炎性细胞浸润,减少肝细胞红色脂滴,降低肝组织IL-1β、TNF-αTG及TC水平。另外,虎杖苷和吡格列酮可显著降低模型动物血清透明质酸、层黏连蛋白、Ⅲ型前胶原蛋白、肝透明质酸和羟脯胺酸水平,减少肝脏窦周隙及中央静脉周围胶原沉积。这些研究结果表明,虎杖苷和吡格列酮可有效改善果糖代谢综合征动物胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血脂紊乱与系统性炎症、以及肝脏炎症反应、脂质蓄积与纤维化。二、虎杖苷调控miR-200a介导Keap1/Nrf2通路干预果糖诱导肝脏炎症及脂质蓄积机制本论文研究高果糖是否下调miR-200a表达水平上调Keap1表达使Nrf2抗氧化通路受损过度产生ROS而引起肝脏炎症反应和脂质蓄积,以及虎杖苷对这些病理过程的干预途径和机制。与课题组前期研究结果一致,高果糖所诱导的肝脏ROS触发了 TXNIP过表达,激活NLRP3炎症小体促进IL-1β生成并干扰脂代谢相关蛋白过氧化物酶体增殖物激活型受体-α(PPAR-α)、肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT-1)、固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD-1)水平,引起大鼠肝脏炎症反应和脂质蓄积。与正常组比较,高果糖模型动物肝脏miR-200a表达水平显著降低,同时,Keap1蛋白水平升高、Nrf2核蛋白水平、抗氧化酶如谷胱甘肽转移酶(GST)、血红素氧合酶1(HO-1)与醌氧化还原酶(NQO1)蛋白水平下降;在体外高果糖处理BRL-3A与HepG2细胞模型上也观察到类似的现象,提示高果糖诱导miR-200a低表达和Keap1/Nrf2通路受损可能参与了肝脏氧化应激过程。为确证miR-200a与Keap1之间可能存在的靶向关系,本文进行了双荧光素酶报告基因实验和miR-200a mimic、Keap1 siRNA转染实验,发现miR-200a可与预测的Keap 1 mRNA 3’UTR中位点结合;同时,miR-200a mimic下调高果糖刺激BRL-3A细胞Keap1蛋白水平(24 h),提示在高果糖处理BRL-3A细胞条件下miR-200a可靶向调控Keap1。为探索miR-200a靶向调控Keap1在氧化应激、炎症及脂质蓄积所起的作用,本文发现miR-200amimic、Keap1siRNA转染均可上调果糖刺激的BRL-3A细胞Nrf2核蛋白水平、GST、HO-1和NQO1蛋白水平(24 h),减少ROS(24 h),降低TXNIP、NLRP3炎症小体、IL-1β、SREBP-1和SCD-1蛋白水平,增加PPAR-α和CPT-1蛋白水平,减低TG和TC水平(48 h)。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(tBHQ)预处理显著增加果糖刺激的BRL-3A细胞GST、HO-1和NQO1蛋白水平(24 h),减少 ROS(24 h),下调 TXNIP、NLRP3 炎症小体、IL-1β、SREBP-1和SCD-1蛋白水平,上调PPAR-α和CPT-1蛋白水平,减低TG和TC水平(48 h)。这些结果表明,高果糖可能通过下调miR-200a表达而上调Keap1使Nrf2抗氧化信号通路受损增加ROS生成,激活TXNIP/NLRP3炎症小体促进IL-1β生成,并干扰脂代谢相关蛋白表达,从而造成氧化应激、炎症与脂质蓄积等肝损伤。虎杖苷和吡格列酮显著上调模型大鼠肝脏miR-200a表达水平,减少Keap1 mRNA和蛋白水平,提高Nrf2核蛋白水平与抗氧化酶水平,抑制氧化应激,下调TXNIP、NLRP3炎症小体、IL-1β、SREBP-1和SCD-1 蛋白水平,上调PPAR-α和CPT-1蛋白水平;在体外高果糖处理BRL-3A与HepG2细胞模型上虎杖苷和吡格列酮也具有类似的作用。进一步分析虎杖苷和吡格列酮在miR-200a mimic转染、Keap1siRNA转染、tBHQ预处理等高果糖刺激BRL-3A细胞模型上效应,发现它们保护肝损伤的新的分子机制,即虎杖苷和吡格列酮可能提高miR-200a表达,修复Keap1/Nrf2通路,减少ROS生成,阻断TXNIP/NLRP3炎症小体激活以降低IL-1β水平,调节脂代谢相关蛋白表达,从而减轻果糖所诱导肝脏氧化应激、炎症与脂质蓄积。三、虎杖苷改善果糖代谢综合征肝纤维化的途径和机制本论文探索高果糖是否引起ZEB1核转位降低miR-200a和miR-203转录水平,以增强survivin激活TGF-β1/Smads信号通路促进肝细胞EMT和肝脏纤维化以及虎杖苷和吡格列酮对这些病理环节的干预机制。与正常组比较,高果糖模型大鼠肝脏ZEB1核蛋白水平显著升高、胞浆蛋白水平显著降低,miR-203表达水平也显著降低,survivin mRNA和蛋白水平却显著升高;调控纤维化因子TGF-β1水平显著升高,TGF-β1、磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)和Smad4蛋白水平显著升高,提示高果糖激活肝脏TGF-β1/Smads通路;另外,肝脏α-肌动蛋白(α-SMA)和胶原蛋白1(COL1A1)蛋白水平显著升高,E钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白水平显著降低,成纤维细胞特异性蛋白1(FSP1)、N-cadherin和vimentin蛋白水平升高,且部分FSP1与COL1A1表达呈现共定位。在体外高果糖处理BRL-3A细胞模型也观察到类似的现象。这些研究结果提示高果糖诱导产生肝细胞EMT现象并发生纤维化。。为探寻高果糖诱导ZEB1核转位在肝细胞EMT上所起的作用,本文首先分析ZEB1核转位与miR-200a与miR-203表达的抑制关系,发现ZEB1 siRNA可上调高果糖所刺激的BRL-3A细胞miR-200a(4 h)和miR-203(12 h)表达水平;miR-200a mimic可显著增加miR-203表达水平,但miR-203 mimic并不显著增加miR-200a表达水平,提示高果糖促进BRL-3A细胞ZEB1核转位下调miR-200a而抑制miR-203表达水平。其次,本文分析高果糖诱导肝细胞miR-200a和miR-203与survivin之间可能存在的靶向关系,发现miR-200a mimic显著降低而miR-200a inhibitor显著升高果糖所刺激的BRL-3A细胞survivin蛋白水平;miR-203可与预测的survivin mRNA 3’UTR中位点结合,其mimic能降低高果糖所刺激的BRL-3A细胞survivin蛋白水平(24 h)。再者,本文聚焦ZEB1核转位抑制miR-200a和miR-203表达在果糖刺激的BRL-3A细胞纤维化所起的作用,并进一步证实ZEB1 siRNA、miR-200a mimic、miR-203 mimic转染果糖刺激的BRL-3A细胞均可显著下调survivin(24 h)、TGF-β1(24 h)、p-Smad2/3蛋白水平及Smad4核转位(48 h),上调E-cadherin,下调FSP1、N-cadherin、vimentin和 COL1A1 蛋白水平(48 h)。而survivin siRNA和TGF-β1 siRNA转染均可减少高果糖所刺激的BRL-3A细胞TGF-β1(24 h)、p-Smad2/3蛋白水平和Smad4核转位(48 h),增加E-cadherin,减少FSP1、N-cadherin、vimentin和COL1A1蛋白水平(48 h)。这些研究结果表明,高果糖可能通过增加ZEB1核转位下调miR-200a而减少miR-203表达水平,上调survivin激活TGF-β1/Smads信号通路促进肝细胞EMT,产生肝脏纤维化。由此推测高果糖诱导ZEB1核转位为“启动开关”抑制miR-200a和miR-203表达水平促进了肝脏纤维化进程。虎杖苷和吡格列酮均显著降低高果糖代谢综合征大鼠肝脏ZEB1核蛋白水平,升高胞浆蛋白水平,增加miR-203表达水平,降低survivin mRNA和蛋白水平,减少TGF-β1水平,降低TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4蛋白水平,增加E-cadherin蛋白水平,减少FSP1、N-cadherin、vimentin、COL1A1和α-SMA蛋白水平;在体外高果糖诱导的BRL-3A细胞模型上,虎杖苷和吡格列酮也有类似的作用。进一步分析虎杖苷和吡格列酮在ZEB1 siRNA、miR-200a mimic、miR-200a inhibitor、miR-203 mimic、survivin siRNA和TGF-β1 siRNA转染合并高果糖刺激BRL-3A细胞模型上效应,发现虎杖苷和吡格列酮改善肝纤维化的新的分子机制,即虎杖苷和吡格列酮可能通过抑制高果糖所诱导的ZEB1核转位而提高miR-200a和miR-203表达水平,这一过程阻断了survivin激活TGF-β1/Smads信号通路,逆转肝细胞EMT,从而抑制肝纤维化。全文总结:高果糖可下调miR-200a而上调Keap1,损伤Nrf2抗氧化信号通路导致ROS蓄积,引发TXNIP过表达激活NLRP3炎症小体,促进IL-1β生成并干扰脂代谢相关蛋白表达,从而造成肝脏氧化应激、炎症与脂质蓄积;增强ZEB1核转位以抑制miR-200a下调miR-203表达水平,上调survivin激活TGF-β1/Smads信号通路,从而促进肝细胞EMT,产生肝纤维化。虎杖苷提高miR-200a表达修复Keap 1/Nrf2通路损伤减少ROS生成,阻断TXNIP/NLRP3炎症小体的激活以降低IL-1β水平,调节脂代谢相关蛋白表达,从而减轻肝脏氧化应激、炎症与脂质蓄积;抑制ZEB1核转位以提高miR-200a和miR-203表达,干扰survivin激活TGF-β1/Smads信号通路,逆转肝细胞EMT,从而缓解肝纤维化。这些研究结果进一步说明了高果糖摄入引发肝脏氧化应激、炎症反应、脂质蓄积与纤维化的新途径和新机制,揭示了虎杖苷对代谢综合征肝损伤的保护作用及其分子机制,为虎杖苷临床防治代谢综合征及其相关肝损伤等提供了实验基础。