环介导等温扩增技术快速检测转基因植物品系的研究

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目前,转基因技术在全球范围内得到了快速的发展。截至2012年,全球转基因作物种植面积达到1.703亿公顷,比1996年增长了100倍。由于人们对转基因生物安全性的忧虑和争论,许多国家和地区先后出台了相关的法律和管理办法,对转基因食品实行强制标识或自愿标识。当前,迫切需要一些快速、灵敏、准确高通量的转基因食品检测方法为这些管理和标识法规的实施提供技术支撑。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日本学者开发的新型体外核酸扩增技术。本论文以转基因植物品系为研究对象,利用ESETube Scanner对SYBR Green I荧光信号的积累,建立LAMP实时荧光法,并评价其对食品与饲料的检测能力。主要研究内容和结果如下:(1)针对转基因水稻Bt63品系设计LAMP引物,通过优化LAMP反应体系中的某些关键影响因素,建立适宜的LAMP浊度法;优化SYBR Green I浓度和FAM通道激发光强度,建立适宜的LAMP实时荧光法。同时对这两种方法的灵敏度、特异性和稳定性进行评价。结果表明,这两种方法都具有较高的灵敏度(0.01%)、较强的特异性和较好的稳定性,但是LAMP实时荧光法比LAMP浊度法的检出时间早,且仪器设备比浊度仪轻便、便宜,更适宜在基层推广和现场使用。(2)分别针对转基因大豆A5547-127、转基因玉米MON89034和转基因玉米MIR604品系设计LAMP引物,建立这3个品系的LAMP实时荧光法,并评价其灵敏度、特异性和稳定性。结果表明,这3个品系的LAMP实时荧光法均具有较高的灵敏度(分别为0.05%、0.1%和0.05%)、较强的特异性和较好的稳定性。(3)研究这4个品系的LAMP实时荧光法对实际食品和饲料的检测能力,同时与欧盟检测标准实时荧光PCR法相比较,进行统计学分析。结果表明,LAMP实时荧光法对A5547-127和MIR604品系的检测与荧光PCR法没有差异;LAMP实时荧光法对Bt63和MON89034品系的检出率比荧光PCR法稍低,但是LAMP技术有其自身的优点,适用于现场检测和在基层推广使用,有不可替代的应用价值。综上所述,本研究建立的LAMP实时荧光法的灵敏度和特异性都能满足欧盟检测标准,为我国转基因快速检测平台的搭建提供一定的技术支持。
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