大头乌龟(Mauremys megalocephala)是一个神秘的物种,系由我国学者方炳文先生1934年发现并命名。国外学者对大头乌龟物种的有效性一直存疑,倾向认为大头乌龟是乌龟的同物异名,其头大是适应取食底栖软体动物的结果;国内学者依据骨骼特征或核型证据则支持其是一个有效种。2005年以来,我们连续多年对安徽及广西等地的9个龟鳖养殖场和龟鳖贸易地进行了专项调查,均未见与方描述的大头乌龟特征相一致的雄性个体,一些疑似大头乌龟的雄性个体,经比较发现,也只是个体较大的乌龟雄性个体。总结前人的研究,也可以发现一个非常有趣的现象,除方炳文先生命名时明确提到大头乌龟的雄性个体外,仅有的几项研究,采用的要么是雌性标本,要么雌、雄含糊不清。这使得我们对大头乌龟的生殖方式——是有性生殖还是孤雌生殖产生了极大兴趣。2008年,本实验室从一个龟鳖养殖场获得了4只大头乌龟雌性成年个体,并进行了隔离饲养。其中一只龟从2012-2013年连续产蛋21枚,其中19枚成功孵化出正常子代(2个因破裂未能孵化)。对于这些子代的来源,有两种可能的解释,一种是由于亲本的长期精子储存产下的子代,一种是亲本孤雌生殖产生了这些子代。为此,本研究采用了7对微卫星引物,扩增获得了大头乌龟亲本及2012年(4只)、2013年(6只)子代的微卫星位点。结果显示,10个子代在7对微卫星位点和亲本基因型完全一致。概率统计分析,若这些子代来源于有性生殖,且10个子代与亲本在7个等位位点基因型相同的概率为:P=(0.5)7x10=8.5×10-22,P值远远小于0.0001,因此,有极小的概率支持这些子代来源于有性生殖,可以排除长期精子储存的可能性。上述的结果使我们有理由推测这只大头乌龟的连续产卵是源于孤雌生殖。这也是第一次发现在龟类动物中存在孤雌生殖的现象。种间杂交可能在行孤雌生殖脊椎动物的物种起源中有着主导作用。大头乌龟分布在长江中下游地区,与黄喉拟水龟(Mauremys mutica)、乌龟(Mauremys reevesii)的分布地重叠。为了探讨大头乌龟的起源,本研究采用PCR扩增、克隆测序获得了大头乌龟、乌龟、黄喉拟水龟共9只个体的ITS2基因序列。基于物种的ITS2序列,采用最大似然法(ML)和贝叶斯分析(BI)方法,以黑靴凹甲陆龟(Manouria emys)和图画闭壳龟(Cuora picturata)为外群重建系统发生树。结果显示:克隆到的大头乌龟两条同源序列,一条聚在乌龟支上,另一条聚在黄喉拟水龟支上,表明大头乌龟可能起源于乌龟和黄喉拟水龟的杂交;根据大头乌龟线粒体基因序列与乌龟的线粒体基因序列高度相似,推测其杂交可能是乌龟(♀)×黄喉拟水龟(♂)。本研究首次发现龟鳖动物中存在孤雌生殖的现象,初步探讨了大头乌龟的杂交起源,研究结果将在物种进化、繁殖生物学和无性克隆动物研究中有重要的理论和实践意义。