在南极洲的沿海水域,海洋鱼类在每年的大部分时间里都经历了接近海水冰点（-1.86°C）的环境温度,并且在南半球夏季只有罕见的变暖期。这些零度以下水域的进化导致了一系列适应性,允许生物在这个寒冷,充满冰的环境中生存,这些适应性进化包括抗冻蛋白的产生,热休克反应的缺失,血红蛋白的丢失,和代谢补偿等。目前在鱼类中主要发现了五种类型的抗冻蛋白,即抗冻糖蛋白（AGFP）、Ⅰ型抗冻蛋白（AFPⅠ）、Ⅱ型抗冻蛋白（AFPⅡ）、Ⅲ型抗冻蛋白（ AFP Ⅲ）和Ⅳ型抗冻蛋白（AFP Ⅳ）。尽管AFP类型在其主要序列和三维结构方面根本不同,但它们都具有相同的性质,即允许它们结合到冰上并降低溶液的凝固点。断线真狼绵鳚（Lycodichthys dearborni）,为辐鳍鱼纲鲈形目绵鳚亚目绵鳚科的一种,分布于南大洋罗斯海海域,属于底栖性鱼类,能够合成Ⅲ型抗冻蛋白（ AFP Ⅲ）。 AFP Ⅲ三维结构是球状的,没有氨基酸组成上的偏向性。先前我们实验室从断线真狼绵鳚（Lycodichthys dearborni）中鉴定到一种含有12个重复结构域的Ⅲ型抗冻蛋白,并命名为ld12。本实验以ld12为模板克隆得到分别含有一个、两个、三个和四个结构域的抗冻基因ld1、ld2、ld3和ld4。传统意义上来说它们抗冻的功能是一种物理学的吸附和抑制功能,没有细胞生理学意义上的生物化学功能。另一方面,越来越多的证据表明,许多抗冻蛋白除了具有抑制冰晶生长的功能外,还具有提高受体动植物耐受低温引起的生化伤害的能力,后者功能不依赖于对冰晶生长的抑制,是一种细胞生理水平的功能。因此,本实验对抗冻蛋白基因ld1、ld2、ld3和ld4在体内和体外同时展开了细胞生理水平上的研究。在体外实验中,构建了能够稳定遗传ld1、ld2、ld3和ld4的ZF4细胞系,并且检测到相应抗冻蛋白能够成功表达。对转基因细胞系进行10°C的低温胁迫后发现,转抗冻蛋白基因的细胞系的细胞毒性明显低于对照组,并且细胞的活性明显高于对照组,表明抗冻蛋白基因能够提高ZF4细胞抵抗低温胁迫的能力。在体内实验中,利用显微注射技术构建瞬时表达抗冻蛋白基因的转基因斑马鱼胚胎,将转基因斑马鱼胚胎进行12°C的低温胁迫24h后进行发育状态观察和统计。从实验结果可以看出,同对照组相比,转抗冻蛋白基因的胚胎的发育状态相对较好,而且胚胎的发育状态同抗冻蛋白的 AFP Ⅲ功能域的数量呈正相关。通过体内和体外实验均证明这些抗冻基因ld1、ld2、ld3和ld4具有在非冰冻温度下保护细胞和生物体抵抗低温伤害的生物学功能,并且在细胞及个体中均能发挥作用,它影响的可能是细胞的基本生命活动过程。同时也发现重复的 AFP Ⅲ结构域越多抗寒性能越强,这也与之前关于抗冻蛋白的抗冻活性与分子量呈正相关的结论一致。为了探究抗冻蛋白的抗寒机制,我们选择抗寒性能最强的ld4作为研究对象进一步探究。以转ld4的ZF4细胞为实验组,转空载体的ZF4细胞为对照组,分别在10°C的低温下胁迫2d后进行转录组和蛋白组测序,利用生物信息学的手段探究和挖掘抗冻蛋白LD4的抗寒机制。通过对转录组和蛋白组分析发现,实验组和对照组存在显著性的差异。通过对两组的差异表达基因和差异表达蛋白分别分析比较,以及将两组进行相关性分析,发现实验组主要富集到的通路有Protein processing in endoplasmic reticulum、Cellular senescence、Regulation actin cytoskeleton、Calcium signaling pathway和Apelin signaling pathway,同转录组富集到的信号通路差别较大,但是和蛋白组的信号通路相似。转录组的差异表达基因主要涉及到Rbosome、Oxidative phosphorylation、Cellular senescence、FoxO signaling pathway、p53 signaling pathway及Spliceosome。蛋白组的差异蛋白主要涉及到Protein processiong in endoplasmic reticulum、Regulation actincytoskeleton和Necroptosis。由此可以说明,低温胁迫下,细胞最终是通过Protein processiong in endoplasmic reticulum、Cellular senescence、Regulation actincytoskeleton、Apelin signaling pathway、Calcium signaling pathway、p53 signaling pathway和Necroptosis来实现应激的,而Rbosome、Oxidative phosphorylation、Cellular senescence、FoxO signaling pathway及Spliceosome是细胞应激反应中经历的过程。结合转录组和蛋白组的分析结果,对LD4可能的抗寒机制进行了实验验证。本实验的一个突破口是寻找与LD4蛋白相互作用的蛋白,通过利用免疫共沉淀技术及串联质谱技术,成功的探究到LD4的相互作用蛋白为Bip蛋白（也称之为GRP78）。它是内质网的分子伴侣,主要参与内质网应激。结合组学分析,我们推测LD4是通过与Bip蛋白相互作用参与内质网的应激来降低细胞的凋亡,从而提高细胞的存活率的,而这种内质网应激可能是钙离子依赖性的。因此,通过对细胞内钙离子的监测和凋亡水平的检测发现,LD4蛋白能够降低胞质内的钙离子浓度,并且降低细胞的凋亡。但是具体的机制还需要进一步探究。本实验室前期的研究发现钙调蛋白（Calmodulin,CaM）在南极鱼类（Dissostichus mawsoni）中的表达非常高（占0.23%）,并且将南极鱼CaM基因转入烟草中发现能够明显的提高低温胁迫下烟草的生长状态,同时发现只保留N端的两个Ca2+结合域（CaMm）具有和完整的结构域（CaM）相同的抗寒效果。而CaM作为Ca2+的感受器,通过调控Ca2+信号通路参与低温胁迫反应中。为了探究南极鱼CaM基因在斑马鱼细胞上是否有同样的功能,以及将CaM和ld4共表达是否能够进一步提高斑马鱼细胞对低温的耐受力,因此利用ZF4细胞构建转基因细胞系进行探究。实验结果表明,在短期胁迫中南极鱼的CaM和CaMm基因均能够提高ZF4细胞抵抗寒冷胁迫的能力,但是随着胁迫时间的延长,南极鱼的CaM和CaMm基因不能持续性的发挥功能。但是,将ld4分别同CaM和CaMm共同转染至ZF4细胞中,发现细胞的耐寒能力得到提高,并且随着胁迫时间的延长,ld4和CaMm共转染的细胞表现出更强的耐寒性能。以上结果说明,南极鱼的CaM和CaMm基因能够提高ZF4细胞的耐寒性能,而且ld4能够使耐寒性能进一步加强,这可能是LD4和CaM共同调控Ca2+信号通路的结果,也进一步说明Ca2+信号通路在LD4抗寒过程中的重要作用。综上所述,我们首次探究并证实了LD4抗冻蛋白的一种新功能-抗寒功能,并且这种功能与分子量呈正相关,即抗寒活性LD4>LD3>LD2>LD1。抗冻蛋白的这种抗寒功能不同与生物物理的吸附抑制功能,而是细胞生理上的功能。这种功能可能是通过钙离子依赖性的内质网应激实现的,最终降低低温胁迫下细胞的凋亡水平。