目的：microRNA（miRNA）调控靶基因通路与p53信号通路相互交叉并相互影响。越来越多的研究揭开了miRNA参与p53信号通路、p53调控miRNA生物合成的相互作用关系。研究表明，p53参与调控多种miRNA的产生及生物学功能。为此，我们构建含有p53保守结合位点的miRNA表达载体，利用p53的转录调控活性使需要研究的miRNA在具有野生型p53蛋白细胞中高效表达并通过调控下游靶基因来发挥生物学功能。同时，利用该载体可以检测各种细胞中的p53是否具有转录活性。方法：改构商业化的miRNA表达载体pCMV-miR，在其多克隆位点前插入p53保守结合位点（p53CON）。为了验证所构建载体的有效性，我们分别将已知受p53调控的miR-138、miR-34a和miR-21前体序列pre-miR-138、pre-miR-34a和pre-miR-21分别插入上述已改构好的载体pCMV/p53-miR。将构建成功的pCMV/p53-miR-138、pCMV/p53-miR-34a和pCMV/p53-miR-21表达载体转染至具有野生型p53的HeLa细胞和不表达p53的H1299细胞中，用荧光定量PCR检测miR-138、miR-34a和miRNA-21表达情况及其已报道过的靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN在mRNA水平的表达变化，用Western-blot检测靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN在蛋白水平的表达变化，分析p53对上述miRNA表达调控的影响。结果：转染改构的miRNA表达载体后，miR-138、miR-34a和miR-21在HeLa细胞中的表达水平明显提高，它们对应的已知靶基因CyclinD3、 CDK2和PTEN在mRNA水平和蛋白水平的表达同时也被显著下调。实验证明了p53与miR-138、miR-34a和miR-21的调控关系，使其下游的靶基因Cyclin D3、CDK2和PTEN也受到调控，验证了所构建载体的有效性。结论：在p53转录调控作用下，具有p53保守结合位点的miRNA表达载体能够更加有效提高miRNA的表达水平，这为进一步研究p53调控miRNA提供了有效工具。构建的载体不但可以用于促进相关miRNA的表达，也能用于p53转录活性的初步检测。深入研究p53与miRNA之间的调控关系，对p53-miRNA信号通路具有重要意义。Ku蛋白是一种进化保守的DNA结合蛋白,主要与DNA相互作用,也有文献报道与RNA有相互作用。人Ku蛋白由2条多肽链通过非共价键紧密结合形成的异二聚体结构，分别称为Ku70（又称XRCC6）和Ku80（XRCC5）。其中Ku80基因位于2q33-34，编码732个氨基酸，相对分子量约83kDa，含有αβ结构域、DNA结合结构域、Ku70结合结构域和DNA-PKcs结合结构域等四个结构域，但与RNA相互作用的功能研究甚少。有研究表明Ku蛋白能够与酵母端粒酶RNA和内部核糖体进入位点序列结合发挥其生物学作用。实验室的前期工作证实Ku80影响miRNA加工过程，为深入开展Ku蛋白多层次多水平参与调控microRNA成熟加工的机制研究，揭示Ku蛋白的全新功能，同时为全面了解microRNA功能提供新的思路，本研究通过构建Ku80及突变体的真核表达载体及在HeLa细胞中的表达，为细胞体内实验打下基础；通过原核表达系统纯化了Ku80及突变体蛋白，结果如下：本研究以Ku80基因的cDNA为模板，PCR扩增Ku80、Ku80缺失αβ结构域(Δαβ)、Ku80缺失DNA结合结构域(ΔDNA)的DNA片段。选取pcDNA6为真核表达载体，选取pET-28a（+）为原核表达载体。将酶切后带有粘性末端的载体分别与Ku80、Ku80Δαβ结构域、Ku80ΔDNA结合结构域的DNA片段连接，转入宿主细胞大肠杆菌DH5α，将测序正确的重组质粒。真核表达质粒转染至HeLa细胞中，采用western-blot鉴定其表达。原核表达质粒转化宿主细胞大肠杆菌BL21，IPTG诱导蛋白表达，SDS-PAGE分析表明均得到正确表达，利用Ni柱进行纯化。表达及纯化的蛋白为今后进一步研究Ku80参与miRNA途径的作用及与双链RNA的结合位点及结构分析打下基础。