子宫内膜异位症（Endometriosis，EM，或简称内异症）是指具有生长功能的子宫内膜出现于子宫体腔内壁以外部位引起的疾患（或一系列病变和症状），是一种雌激素依赖性疾病。临床表现为痛经、不孕、慢性盆腔痛、性交痛、盆腔包块、急腹症，甚至恶变等，是生育期女性常见疾病，发病率高达10%～15%，近年来，子宫内膜异位症的发病率继续呈显著的上升趋势，其中近50%的患者合并不孕。更为严重的是，EM虽为良性疾病，异位子宫内膜却具有浸润、扩散和远处转移等类似恶性行为，全身多处（如鼻腔、肺部、肾脏、输尿管、膀胱、肠道等）均可发病，被称为“良性癌”。目前EM治疗方法虽多，却都疗效有限。疗法主要包括期待疗法、药物（内分泌）治疗、手术治疗、综合治疗等。除根治性手术（切除子宫和双附件）外，治疗后复发率高达50%。但根治性手术后妇女彻底丧失了生育功能与内分泌功能，对于正值生育期的广大患者极不适用。而目前常用的治疗药物副作用较大（如体重增加、肝功能损害和绝经期综合征等），不能长时间连续使用。因此，EM是一种严重影响患者身心健康、家庭和谐的疑难疾病。 总体而言，EM的发病机制不清，目前治疗方法虽多，却疗效欠佳，复发率高，严重影响妇女身心健康，迫切需要进一步深入探寻其发病机制和新的治疗方法。 目的: 本课题拟利用人血管内皮细胞、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和裸鼠等EM体内外血管生成模型，利用小分子RNA靶向NF-κB基因实施干扰，探讨NF-κB信号通路在EM发生发展中的作用及分子机制，为EM的发病机制提供新内容，为EM的治疗开辟一条新途径，以期治愈疾病，减少复发。 方法: 1.根据基因Bank公布的序列，合成NF-κB siRNA，复苏人血管内皮细胞株EAhy926细胞，并予以VEGF刺激培养，建立血管生成体外模型，以阳离子脂质体2000（LipofectamineTM2000）为转染试剂，向细胞内转染NF-κB p65 siRNA、阴性siRNA和生理盐水，48 h后收获细胞，分别以RT-PCR及Western blot方法检测NF-κB在核酸及蛋白水平，以判断是否成功抑制NF-κB基因；同时采用MMT、流式细胞仪及Hoechst染色等方法检测血管内皮细胞的活性、迁移率及凋亡率，以评估NF-κB p65 siRNA对血管内皮细胞生长的影响。 2.选择7d龄鸡胚80只，分4组，每组20只，一组为不加任何干预措施的空白组，另三组于相对无血管处种植子宫内膜碎片，建立人内异症鸡胚绒毛尿囊膜微血管生成模型，分别向种植之内膜转染NF-κB p65 siRNA、阴性对照siRNA和生理盐水，转染14 d后取出鸡胚，对整个CAM于解剖显微镜下进行摄片、软件处理分析各血管生成指标，如血管数目（VN）、血管面积（VA）和血管面积/鸡胚绒毛尿囊膜面积比（VA/CAM）等，并将种植物送病理检查，以评价NF-κB p65 siRNA对CAM血管生成的影响。 3.将6～8w龄的BALB/c雌性裸鼠30只随机分为3组，均向腹腔注入EM患者的子宫在位内膜，再分别向腹腔内注入NF-κB p65 siRNA、阴性对照siRNA和生理盐水，14 d后处死裸鼠，收集腹腔液，观察子宫内膜种植病灶，比较各组成模率，ELISA法检测腹腔液中VEGF、MMP-9及ICAM-1等因子的浓度，以及免疫组化检测异位内膜病灶中NF-κB、ICAM-1及VEGF的表达强度，以探索NF-κB在防止EM发生方面的效果及其作用机制。 4.选择10只BALB/c雌性裸鼠，给予皮下注射子宫内膜碎片造模，14 d处死，计算建立人EM裸鼠皮下种植模型成功率。 5.按第4步方法建立人EM裸鼠皮下种植模型30只，4w后待病灶生长至4 mm×4mm，将其随机分为3组，分别向异位内膜病灶内注射NF-κB p65siRNA、阴性对照siRNA和生理盐水。测量异位内膜病灶的生长体积变化，14 d处死全部裸鼠，比较病灶的体积与重量，同时免疫组化检测VEGF等因子的表达强度以及微血管密度（MVD），并比较转染前后裸鼠体质量、食欲、毛色等情况，分析抑制NF-κB基因对异位内膜生长和血管生成的影响以及可能出现的毒副作用，评价其用于EM治疗的可行性与疗效。 结果: 1.成功复苏人血管内皮细胞株EAhy926细胞并予VEGF刺激培养，建立了良好的血管生成的体外模型；与对照组比较，转染NF-κB p65 siRNA组48 h后，光镜下见细胞明显较稀疏，脱壁较多，贴壁力弱，部分细胞肿胀变圆或破碎，核分裂象减少；PT-PCR及Western blot检测示细胞内NF-κB mRNA与蛋白表达均减少；同时，血管内皮细胞增殖率、迁移率下降，细胞凋亡率升高（P<0.05）。 2.成功建立人内异症CAM血管生成模型，与空白组CAM比较，单纯接种子宫内膜CAM的新生血管的密度增加，且以病灶为中心呈放射状生长；与单纯接种组CAM比较，NF-κB p65 siRNA组CAM的新生血管明显稀疏，且分布无规律；阴性对照siRNA组CAM的新生血管密度与单纯接种组类似，血管密度增加，但走向稍紊乱。血管生成指标定量分析比较，NF-κB siRNA组CAM的VN、VA以及VA/CAM少于阴性对照siRNA组与单纯接种组（P<0.05）），后两者之间差异则无显著性意义。HE染色观察异位种植之内膜，转染NF-κB siRNA者内膜腺体结构松散甚至破碎，对照组则腺体完整，发育良好。 3.各组裸鼠腹腔模型成功率分别为20%、80%和70%，转染NF-κB p65siRNA组最低（x2=8.136，P=0.017）。病灶多位于盆腹腔的腹壁、肠系膜、肠管和肝表面，直径约2.0～3.0 mm左右，呈清亮水疱样结构，表面有小血管爬行，部分可见粘连带与腹壁相连。光镜下，单纯接种及阴性siRNA组存活的异位内膜可以看到完整的腺体及间质结构。而NF-κB p65 siRNA组亦可见腺体及间质结构，但部分可见发育不良或坏死。NF-κB p65 siRNA组腹腔液中VEGF、MMP-9和sICAM-1各因子浓度，以及内异灶中NF-κB、VEGF、sICAM-1的表达强度均低于其他两组（P<0.05），而阴性siRNA组与单纯接种组间差异则无统计学意义。 4.10只裸鼠有8只皮下种植成模，成功率为80%，1只死于感染。每3d观察一次种植病灶结节，约于第12 d形成大小约2.0 mm×2.0 mm×2.0 mm结节样突起。HE染色后光镜下均可见类似子宫内膜样的腺体和间质结构，腺上皮细胞呈柱状或扁平状，病灶边缘与裸鼠肌细胞层相延续，部分切片中有间质细胞侵入肌层的现象；VEGF蛋白阳性表达表现为胞浆棕色颗粒，在异位病灶组织的腺上皮、间质及血管内皮中均有表达；CD34阳性染色定位于血管内皮细胞，呈棕黄色，微血管有的形成管腔，有的仅为单个内皮细胞或内皮细胞簇，表明已出现血管生成现象。 5.转染NF-κB p65 siRNA组的皮下内异灶体积和重量均低于阴性对照及空白对照组（P<0.05）：其对异位内膜病灶生长抑制率高于阴性siRNA组（57.39%vs25，81%，P<0.05）。HE染色后，光镜下可见NF-κB p65 siRNA组腺体萎缩明显，部分结构不完整，间质伴有不同程度的坏死。免疫组化结果显示，NF-κB p65siRNA组内异灶中VEGF表达、MVD值均低于阴性对照及空白对照组（P<0.05）各组实验裸鼠均未观察到明显的毒副反应。 结论: 1.NF-κB siRNA可以有效抑制NF-κB基因，阻断NF-κB的活化，抑制血管内皮细胞EAhy926的增殖与迁移能力，促进其凋亡，从而减弱其血管生成能力。 2.NF-κB siRNA可以抑制人子宫内膜异位种植鸡胚模型的新生血管形成，并同时对异位内膜细胞的生长有抑制作用。 3.靶向NF-κB的siRNA可以降低子宫内膜异位种植的能力，提示可能调控人EM的发生，抑制NF-κB的活化可能有助于预防EM的发生，其作用机制可能与全面下调与粘附、侵袭和血管生成的相关的靶基因表达有关。 4.EM患者的在位子宫内膜具有较强的异位种植及促新生血管生成能力，可以作为建立人EM动物模型种植物的材料；裸鼠作为一种免疫缺陷动物，能保持异种源性移植物（如人子宫内膜）原有的生长、形态及生化活性，有利于反映疾病本身的发生发展和特性，是一种良好的内异症模型动物。皮下种植是成功率较高的造模方式，且未观察到明显的毒副作用，具有较高的安全性。 5.NF-κB siRNA对已存在的内异灶生长具有明显的抑制效应，且未观察明显的毒副反应。 综上以为，靶向NF-κB的siRNA对EM有一定的预防和治疗作用，且未见明显的毒副反应，可以作为防治EM的一个安全有效的新方法。